Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 02 maja 2016

Liczba komentarzy: 0
Mykoplazma, czyli laboratoryjna zmora wszystkich „komórkowców”

Bakterie z rodziny Mycoplasma potrafią „zatruć” (nie tylko w cudzysłowie) życie wszystkim pracującym z hodowlami komórkowymi, czy tkankowymi w warunkach in vitro. Te małe, pozbawione ściany komórkowej drobnoustroje, w przeciwieństwie do innych typów bakterii są oporne na rutynowo stosowane antybiotyki, takie jak penicylina, czy inne β-laktamy (powodujące rozkład peptydoglikanu, będącego głównym składnikiem bakteryjnej ściany komórkowej). Ich nieprzeciętne wymiary (0,3 – 0,8 µm średnicy, czyli około 5 razy mniej niż pojedyncza komórka Escherichia coli!) powodują kolejny problem — bakterie te przechodzą przez powszechnie stosowane w sterylizacji celulozowe lub poliwinylowe filtry o średnicy porów 0,45 µm. Nasze laboratoryjne hodowle komórkowe stanowią dla nich idealne środowisko życia, gdyż do ich wzrostu konieczne są takie katabolity, jak na przykład cholesterol, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, czy witaminy. Gdy dodamy do tego ich kolejną cechę, jaką jest niestabilność osmotyczna (komórki osłonięte są jedynie prostą błoną komórkową) — wyjaśnia się, dlaczego te drobnoustroje mogą być laboratoryjną zmorą.

Brzmi nieciekawie? Niestety jest znaczniej gorzej. Nawet pracując w idealnie sterylnych warunkach zakażamy hodowle komórkowe tymi bakteriami sami, najczęściej poprzez zanieczyszczone składniki pożywek hodowlanych. Nie mamy pojęcia, że doszło do zakażenia, gdyż drobnoustroje te przyczepiają się do powierzchni komórek eukariotycznych (czerpiąc od nich składniki pokarmowe), przez co nie obserwujemy charakterystycznego dla zakażenia bakteryjnego zmętnienia pożywki. Niczego nie świadomi prowadzimy hodowlę, w której zainfekowane komórki przechodzą szereg przemian, takich jak na przykład zmiany w metabolizmie i wzroście, czy aberracje chromosomowe, przez co wyniki naszych doświadczeń mogą znacząco odbiegać od rzeczywistych obserwacji.

Jak więc tego uniknąć? Po pierwsze, rutynowo testować wszystkie linie komórkowe na obecność Mycoplasma sp. Istnieje kilka metod, które są wykorzystywane w tym celu, z których godne polecenia są dwie poniższe.

Test genetyczny — PCR

Metodą łańcuchowej reakcji polimeryzacji możemy szybko i tanio wykryć obecność tych niepożądanych drobnoustrojów. Zestaw specyficznych starterów (które zapewnia np. Primagen), specyficznych względem sekwencji w operonie rRNA (wysoko zmiennego regionu, pomiędzy genami podjednostek 16S i 23S) wykrywa wszystkie szczepy Mycoplasma. Zalecane jest wykonanie dwóch reakcji: PCR1, w której matrycą w reakcji jest DNA wyizolowane z hodowli komórkowej oraz PCR2, gdzie matrycę stanowi produkt reakcji 1 (tak zwany zagnieżdżony PCR, z ang. nested PCR). Wykonanie PCR2 zwiększa znacząco czułość testu, umożliwiając wykrycie nawet bardzo słabej infekcji.

PCR na Mycoplasma sp.
Fotografia przedstawiająca wynik testu PCR na obecność mykoplazmy w hodowlach komórkowych. Specyficzny produkt pojawił się we wszystkich przetestowanych liniach (brak prążka jedynie w próbce będącej negatywną kontrolą - ostatnia studzienka).

Uwagi (z życia wzięte): Główną zaletą tej metody jest jej prostota i szybkość wykonania (wynik testu dostajemy jeszcze tego samego dnia). Za jej stosowaniem przemawia także niski koszt wykonania eksperymentu. Jednakże, istnieje jedna zasadnicza wada — test ten jest bardzo czuły i nie nadaje się do wykorzystania w laboratoriach średniej czystości, gdyż specyficzne produkty reakcji 2 mogą pojawiać się nawet w kontroli negatywnej.

Test fluorescencyjnego barwienia DNA

Inną metodą wykorzystywaną do identyfikacji zakażenia Mycoplasma sp. w hodowlach in vitro jest barwienie DNA za pomocą takich substancji, jak Hoechst (33258, 33324 lub 34580), czy DAPI. W tym celu konieczny jest pasaż komórek na wcześniej wysterylizowane szkiełka mikroskopowe, a po kilku dniach hodowli (zazwyczaj 3-4) utrwalenie i wybarwienie takich preparatów. Zalecanym utrwalaczem jest mieszanina kwasu octowego i metanolu (w stosunku 1:3). Tak przygotowane preparaty analizuje się za pomocą mikroskopu, wzbudzając fluorescencję odpowiednią długością fali świetlej. Jeśli obserwujemy świecenie jedynie jąder komórkowych to oznacza, że nasze hodowle są czyste. W przeciwnym wypadku w polu widzenia dostrzec można także małe świecące punkty (DNA bakteryjne), które znajdują się na obrzeżach pojedynczych komórek, przyczepione do błony.

Uwagi: Test ten jest wiarygodny, tani i również szybki w wykonaniu (nie licząc kilku dni hodowli komórek na szkiełkach, które są konieczne, aby umożliwić wzrost ewentualnych bakterii). Samo barwienie zajmuje mniej czasu niż PCR, a koszt pojedynczego eksperymentu jest porównywalny lub nawet niższy. Natomiast niezaprzeczalnymi wadami są: posiadanie specjalistycznej aparatury (mikroskop fluorescencyjny lub świetlny z możliwością fluorescencji) oraz znacznie mniejsza czułość metody (słaba infekcja nie zostanie wykryta).

Mam w hodowli mykoplazmę — co robić?

Oczywiście leczyć! Większość linii komórkowych może być z powodzeniem uwolniona od tych drobnoustrojów poprzez kurację antybiotykiem z grupy fluorochinolonów (hamujących bakteryjną topoizomerazę — gyrazę DNA), jakim jest ciprofloksacyna. Do takiej terapii polecam stężenie 5-10 ug/ml  przez 2 tygodnie, po czym po około tygodniu od zaprzestania podawania antybiotyku należy wykonać ponownie test. Jeśli bakterie są nadal obecne w hodowli można powtórzyć kurację, przy czym należy regularnie obserwować komórki, gdyż bardziej wrażliwe linie lub komórki pierwotne mogą obumierać.

Mykoplazma zniknęła! Co teraz?

Można uniknąć zakażeń tymi bakteriami poprzez utrzymywanie profilaktycznego stężenia ciprofloksacyny, które wynosi 0,5 ug/ml. Ilość ta jest całkowicie nieszkodliwa dla komórek eukariotycznych, natomiast nie pozwala za wzrost mykoplazmy. Nadal jednak polecam wykonywanie testu w kierunku obecności tych bakterii (na przykład raz na miesiąc), a w szczególności dla nowych linii komórkowych!

Fotografie komórek zakażonych przed leczeniem (BEFORE) oraz po leczeniu antybiotykiem (AFTER) można zobaczyć tutaj.

AM

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry