Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 06 maja 2013

Liczba komentarzy: 1
Najpopularniejsze metody stosowane w biotechnologii — elektroforeza białek

Wraz z rozwojem nauki w zakresie budowy materii i cząsteczek pojawiła się potrzeba rozdzielania cząstek charakteryzujących się różnymi właściwościami i wielkością. Opracowano wiele metod wykorzystujących różne zjawiska fizyczne, jednak najbardziej popularnymi okazały się techniki elektroforetyczne.

Elektroforeza wykorzystuje zdolność migracji różnych biocząsteczek. Jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego białka obdarzone ujemnym ładunkiem elektrycznym przemieszczają się w kierunku od anody do katody w odpowiednio przygotowanych żelach, których cząsteczki tworzą sieć ograniczającą swobodną migrację cząsteczek. W wyniku tych „utrudnień” szybkość przemieszczających się białek lub kwasów nukleinowych zależy od ładunku, wielkości i budowy cząsteczek.

Powszechnie stosowane metody elektroforetyczne są kombinacjami lub pochodnymi trzech podstawowych rodzajów separacji. Pierwszym z nich jest elektroforeza strefowa, która odbywa się w nośniku, w którym elektrolit ma w całej objętości stałą wartość pH. Jest ona podstawowym i najszerzej stosowanym rodzajem elektroforezy. Izotachoforeza odbywa się w nośniku,w którym występuje nieciągłość wartości pH, co oznacza, że próbki migrują w obszarze pomiędzy dwoma elektrolitami o różnej wartości pH i różnej ruchliwości jonów. Ostatni rodzaj separacji to ogniskowanie izoelektryczne, w którym rozdział odbywa się w nośniku, w którym wartość pH buforu zmienia się w sposób ciągły od wartości najwyższej przy katodzie do najniższej przy anodzie.

Podstawowy podział odmian technik elektroforetycznych

Elektroforeza natywna prowadzona jest zwykle w poliakrylamidzie w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane. Zaletą tej metody jest możliwość odzyskania aktywnych biologicznie cząsteczek białkowych, natomiast wadą słaba rozdzielczość.

Elektroforeza w obecności SDS jest najczęściej wykorzystywana do rozdziału białek. Zastosowanie siarczanu dodecylu sodu (SDS), substancji powierzchniowo czynnej, przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości. Ponadto separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Również barwienie kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka.

Elektroforeza nieciągła jest połączeniem izotachoforezy z elektroforezą strefową. Wykorzystuje się w niej dwa kontaktujące się ze sobą elektrolity o różnym składzie i różnej wartości pH. W górnej części znajduje się żel zagęszczający, w którym zachodzi izotachoforeza. Uporządkowane i zagęszczone tam cząsteczki białka przechodzą do drugiej części nośnika zwanej żelem separującym, w którym realizuje się elektroforeza strefowa. Dzięki zastosowaniu tych dwóch rodzajów separacji uzyskuje się ostre prążki zawierające białka o tej samej ruchliwości elektroforetycznej, co często jest interpretowane jako białka o tej samej masie cząsteczkowej.

Ostatnią odmianą technik elektroforetycznych jest elektroforeza 2D łącząca dwa, a czasem nawet trzy rodzaje separacji. Procedura rozpoczyna się od separacji białek techniką ogniskowania izoelektrycznego, które wykonuje się przy pomocy elektroforezy rurkowej (elektroforeza pionowa) lub na paskach nośnika w elektroforezie poziomej. Etap ten zwany jest pierwszym kierunkiem (wymiarem) elektroforezy 1D. Następnie dokonuje się rozdziału cząsteczek według mas cząsteczkowych. W tym celu może być stosowana elektroforeza nieciągła, czyli izotachoforeza oraz elektroforeza strefowa, ale często stosuje się jedynie elektroforezę strefowa. Po zakończeniu procedury 2D i wybarwieniu żelu uzyskuje się dwuwymiarową mapę rozkładu białek. Przy zastosowaniu tej metody w łatwy sposób można rozdzielić na jednym żelu kilka tysięcy białek. Ponadto pozwala ona na stosunkowo łatwą analizę zmian ekspresji genu kodującego analizowane białko.

Wizualizacja wyników

Sam rozdział nie kończy procedury separacji. Konieczna jest jeszcze wizualizacja rozdzielonych biocząsteczek, ponieważ z reguły są one nie widoczne w białym świetle. Białka najczęściej barwi się barwnikami takimi jak błękit kumassi (ang. Coomassie  Blue) czy czerń amidowa. Inną możliwością jest znakowanie radioizotopowe, które odbywa się zawsze przed procesem separacji elektroforetycznej, często na etapie syntezy. Do znakowania białek i peptydów najczęściej wykorzystuje się izotopy jodu 125I lub 131I, rzadziej izotopy węgla 14C, wodoru 3H lub siarki 35S. Szczególnym rodzajem wizualizacji białek jest barwienie enzymatyczne. Jego zastosowanie ograniczone jest tylko do białek enzymatycznych, które w wyniku katalizy produkują barwny substrat.

Techniki elektroforetyczne są metodami bardzo często stosowanymi w praktyce laboratoryjnej i trudno sobie wyobrazić wykonanie wielu eksperymentów bez ich zastosowania.

Szczególnie zainteresowanym polecam animację.

Katarzyna Kamel

Źródło:

Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowiskowej, A. Raszka, A. Ziembińska, A. Wiechetek

Elektroforeza — przykłady zastosowań, pod red. B. Walkowiaka i V. Kochmańskiej

Elektroforeza
image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    O ile się nie mylę, to ani Coomassie Brilliant Blue ani czerń amidowa NIE SĄ barwnikami naturalnymi.

    Jeżeli się mylę, to czy autorka może podać z jakich źródeł naturalnych (zwierząt, grzybów, roślin, bakterii lub minerałów) pozyskuje się te dwa barwniki?

    3 lata temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry