Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 05 kwietnia 2016

Liczba komentarzy: 0
Zanim sami zbudujemy RNA

Autor wpisu
dr Krzysztof Olszak
dr Krzysztof Olszak

W artykule Biotechnologia „zrób to sam” zaprezentowany został program EteRNA pozwalający na zabawę w samodzielną budowę nieistniejącego w naturze RNA. Dla wielu osób może być to wspaniała zabawa związana z nauką. Jest to przecież doskonała okazja do zapoznania się z RNA i jego budową, a jeśli wygenerowana struktura zostanie uznana za interesującą i zostanie zsyntetyzowana przez twórców programu, to satysfakcja będzie jeszcze większa. Oczywiście są tam zamieszczone instrukcje mające pomóc użytkownikowi, omawiające podstawowe założenia związane ze strukturą kwasów rybonukleinowych. Warto jednak spojrzeć na te zagadnienie szerzej, łącząc je również z wieloma funkcjami, jakie mają za zadanie spełniać w każdej komórce różni przedstawiciele rodziny RNA.

Pisząc o kwasach rybonukleinowych (RNA) najlepiej jest rozpocząć od samego początku, czyli kwestii pojawienia się życia na Ziemi. Problem ten zaowocował powstaniem wielu różnych scenariuszy opisujących to zjawisko tak w sferze kultury, wierzeń ludzkich, jak i w świecie nauki. W latach sześćdziesiątych XX wieku pojawiły się dwie teorie dążące do rozwiązania tego problemu. Pierwszą z nich jest teoria pierwszeństwa białek (Protein First Theory), a drugą teoria świata RNA (RNA World). O ile same założenia tej drugiej teorii znano już przed półwieczem, to jej nazwa jest znacznie młodsza. W odniesieniu do teorii powstania życia jako pierwszy użył jej Walter Gilbert opisując w Nature autokalityczne właściwości RNA.

W ostatnich latach w miarę rozwoju wiedzy o kwasach rybonukleinowych, przyjęło się określać mianem „Świata RNA”, nie tylko tematykę związaną z jedną z teorii na temat powstania życia, ale też ogół zagadnień, jakie są poruszane w pracach badawczych na temat budowy i funkcji RNA. Kwasy rybonukleinowe są dużą grupą bardzo zróżnicowanych cząsteczek zaangażowanych w różne procesy zachodzące w komórce.

RNA można podzielić ze względu na ich właściwości na dwie grupy — niekodujące i kodujące białka. Do tej drugiej grupy zaliczamy matrycowy RNA (mRNA). Do niekodujących RNA (ang. non coding RNA — nc RNA) należy cały szereg cząsteczek. Można z nich wydzielić dwie grupy: konstytutywne i regulatorowe RNA. W skład konstytutywnych RNA można zaliczyć RNA związane z procesem translacji (tRNA, rRNA, tmRNA), dojrzewania RNA (snRNA, snoRNA, Rnaza MRP, Rnaza P), replikacji (RNA telomerazy), lokalizacji białek (4.5S RNA, 7SL RNA). Do grupy regulatorowych RNA zaliczyć można regulatory transkrypcji, regulatory potranskrypcyjne, modulatory aktywności białek (np. opisywany ostatnio SCAANT1), regulatory lokalizacji RNA.

Niebagatelną rolę w funkcjonowaniu RNA odgrywa struktura cząsteczki. Kwasy rybonukleinowe w porównaniu do kwasu deoksynukleinowego (DNA) wykazują się dużą różnorodnością funkcji oraz budowy. W dostępnej literaturze znajduje się wiele doniesień przedstawiających zależność funkcji od budowy kwasów rybonukleinowych. W przypadku RNA istotna jest nie tylko sekwencja nukleotydowa (struktura pierwszorzędowa), ale również ich struktura drugorzędowa, oraz przestrzenna (trzeciorzędowa). Każdy z tych elementów spełnia istotną funkcję w procesach, w jakie zaangażowane są RNA. W przypadku, gdy RNA tworzy dla przykładu, kompleksy z białkiem, istotne jest nie tylko dopasowanie sekwencji lub pojedynczych aminokwasów rozpoznawanych przez białko, ale również dopasowanie struktury przestrzennej. Dobra znajomość budowy RNA jest niezbędna do zrozumienia z jednej strony zaburzeń w funkcjonowaniu organizmu, jakie mogą występować w wyniku pojawienia się mutacji w genach RNA; stanowi także pierwszy krok na drodze do wykorzystania kwasów rybonukleinowych w terapii. Takie możliwości zastosowania w medycynie istnieją w przypadku krótkich RNA, ryboprzełączników występujących w mRNA czy oligonukleotydów RNA lub DNA (aptamery).

Podstawą powstania i utrzymania odpowiedniej struktury RNA jest szereg zależności termodynamicznych określonych dla poszczególnych fragmentów RNA, jak i dla całej cząsteczki. Z punktu widzenia termodynamiki najtrwalsza jest struktura o najniższej energii swobodnej, będącej sumą energii poszczególnych fragmentów struktury cząsteczki. Te właściwości wykorzystano w niektórych programach do przewidywania struktury drugorzędowej RNA. Tego rodzaju program mając podaną sekwencję przelicza wartości energii swobodnej i proponuje różne wersje struktury drugorzędowej, jakie mogą powstać dla podanej sekwencji nukleotydów. Za przykład tego typu programu może posłużyć m-fold, który został opracowany przez zespół Michaela Zukera.

 

Rys. 1: Przykładowy schemat struktury drugorzędowej RNA

Łańcuch RNA złożony jest z nukleotydów. Są to organiczne związki zbudowane z reszty cukrowej — rybozy, reszty fosforanowej, zasad azotowych z grupy puryn: guaniny (G), adeniny (A), oraz pirymidyn: cytozyny (C) oraz uracylu (U), który odróżnia swoją obecnością łańcuch RNA od DNA, gdzie zamiast uracylu występuje tymina. RNA zbudowane są z pojedynczego łańcucha nukleotydowego, który w procesie formowania cząsteczki RNA fałduje się tworząc fragmenty helikalne (dwuniciowe), oraz różne motywy jednoniciowe w strukturze drugorzędowej i trzeciorzędowej. Głównym motywem strukturalnym kwasów rybonukleinowych jest podwójna helisa utworzona przez komplementarne pary zasad C-G, G-C, A-U oraz U-A. Pary te nazywane są parami Watsona-Cricka (pary W-C). Tworzą ją dwa łańcuchy polirybonukleotydowe ułożone antyrównolegle względem siebie i skręcających się w prawo wokół wspólnej osi. W przeciwieństwie do DNA, gdzie fragmenty helikalne tworzą niemal całą strukturę cząsteczki, w RNA odcinki te stanowią nieco ponad 50% wszystkich elementów strukturalnych. Pozostałe elementy struktury drugorzędowej są tworzone przez te fragmenty łańcucha RNA, które nie są włączone do podwójnej helisy. Są to pojedyncze niesparowania (ang. single mismatches), wybrzuszenia jednostronne (ang. bulges) wybrzuszenia dwustronne (ang. internal loops), terminalne niesparowania (ang. terminal mismatches) struktury szpilkowe (ang. hairpin loops), pseudowęzły (ang. pseudoknots), wybrzuszenia wieloramienne (ang. multibranch loops), współosiowe oddziaływania warstwowe (ang. coaxial stacking). Wszystkie wymienione tu motywy strukturalne mają wpływ na trwałość i stabilność struktury RNA.

Wybrzuszenia jednostronne występują wówczas, gdy niesparowane nukleotydy znajdują się tylko w jednym z łańcuchów helisy RNA. W naturalnych RNA najczęściej spotykane są wybrzuszenia jednostronne w postaci pojedynczej adenozyny. Wybrzuszenia te powodują „zgięcie” helisy RNA.

Wybrzuszenia dwustronne występują, gdy nukleotydy zlokalizowane naprzeciw siebie nie tworzą pary Watsona-Cricka, czyli pary C-G, G-C, A-U i U-A. Gdy w obu łańcuchach występuje taka sama ilość nukleotydów jest to niesparowanie symetryczne. W przypadku, gdy są to pojedyncze nukleotydy, nazywane są pojedynczymi niesparowaniami. Bardzo często spotykane są pojedyncze niesparowania tworzone przez pary G-U i G-A.

Kolejną grupą wybrzuszeń dwustronnych są tandemowe niesparowania. Sytuacja taka ma miejsce, gdy obok siebie występują dwa pojedyncze niesparowania o symetrycznym układzie nukleotydów na przykład bardzo często spotykane G-U i U-G.
Wybrzuszenia szpilkowe powstają, gdy łańcuch RNA zwinie się tworząc dupleks i pozostawiając między oboma częściami tego dupleksu grupę niesparowanych nukleotydów tworzących w ten sposób jednoniciową pętlę. Struktury szpilkowe są bardzo często spotykane w RNA występujących w naturze.

Pseudowęzły, chociaż związane ze strukturą drugorzędową można zaliczyć do oddziaływań trzeciorzędowych, związanych z budową przestrzenną cząsteczki RNA. Struktura trzeciorzędowa jest utrzymywana przez szereg oddziaływań występujących między poszczególnymi nukleotydami. Są to oddziaływania międzycząsteczkowe (jony magnezu, cząsteczki wody, poliaminy), oraz wewnątrz cząsteczkowe (wiązania wodorowe, asocjacja warstwowa zasad, energia konformacyjna cząsteczki). W oddziaływania trzeciorzędowe zaangażowane są różne fragmenty RNA, głównie opisane powyżej motywy struktury drugorzędowej powstające z jednoniciowych odcinków kwasów rybonukleinowych. Można w ten sposób wyróżnić oddziaływania pomiędzy dwoma fragmentami jednoniciowymi (np. pętla — pętla), fragmentem jednoniciowym i podwójną helisą (pętla — podwójna helisa) oraz pomiędzy dwoma podwójnymi helisami.
Wpływ na stabilność struktury mogą mieć same nukleotydy, nie tylko przez to, jakie tworzą pary W-C, ale również gdy zostaną zmodyfikowane chemicznie.

Zmodyfikowane nukleozydy są charakterystycznym elementem występującym najczęściej w transferowych kwasach rybonukleinowych (tRNA). Chemiczne modyfikacje nuklezydów występują już po trakskrypcji tRNA, na etapie dojrzewania pre-tRNA. Kolejność wystąpienia modyfikacji, zależy od struktury pre-tRNA w określonym etapie dojrzewania oraz od przestrzennego rozmieszczenia w komórce enzymów modyfikujących. Modyfikacje mogą być proste — takie jak metylacja czy redukcja, a mogą też być efektem skomplikowanych procesów w wyniku, których mogą pojawić się hiperzmodyfikowane nukleozydy. Obecnie znana jest znaczna liczba (ponad 80) takich modyfikacji występujących w tRNA. Można wyróżnić takie, które występują we wszystkich królestwach żywych organizmów, a są też takie, które można napotkać, na przykład tylko u Eucaryota. Najważniejszą funkcją modyfikowanych nukleozydów jest stabilizacja struktury RNA. Taki efekt daje dla przykładu izomeryzacja urydyny do pseudourydyny. Mogą brać też udział w rozpoznawaniu RNA przez białka tworzące z RNA kompleksy, takie jak aminoacylosyntetaza i odpowiadająca jej cząsteczka tRNA.
Na koniec jeszcze warto poruszyć kwestię badania struktury RNA.

Do prób przewidywania i opisania struktury RNA można wykorzystać nie tylko dane generowane przez odpowiednio napisane algorytmy wykorzystane w programach generujących modele struktury RNA (mfold, Vienna RNA Package, ModeRNA), ale również dane doświadczalne. Pierwsze próby badań struktury RNA przeprowadzono pod koniec lat sześćdziesiątych. Stosuje się w tym celu różne metody. Najbardziej precyzyjną z nich jest krystalografia RNA lub kompleksów RNA z białkiem. RNA bada się także w roztworze z zastosowaniem promieniowania X czy też magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Dużo cennych informacji można uzyskać poprzez wykorzystanie w tym celu sond chemicznych lub enzymatycznych. Sondy chemiczne są to związki chemiczne, a z kolei sondy enzymatyczne są białkami — nukleazami, które specyficznie reagują z RNA. Specyficzność reakcji polega na hydrolizie wiązań fosfodiestrowych w łańcuchu RNA w wybranych miejscach, na przykład za tymi miejscami w łańcuchu gdzie umiejscowione są wybrane nukleotydy lub ich sekwencje, albo w miejscach gdzie łańcuch RNA nie tworzy podwójnej helisy. Z sond chemicznych można wymienić niektóre związki ołowiu, siarczan dimetylu lub pirowęglan dietylu.

Z grupy sond enzymatycznych jako przykłady można podać nukleazę V1 pochodzącą z jadu węża Naja  oxiana (Kobra środkowoazjatycka), która jest specyficzna wobec podwójnej helisy. Z grupy enzymów hydrolizujących wiązania fosfodiestrowe w jednoniciowych fragmentach RNA można wymienić kilka enzymów. Specyficzna wobec wybranych sekwencji jest RNaza T84 oczyszczona z ludzkich komórek raka jelita grubego. Jest ona specyficzna wobec sekwencji 5’GU3’, oraz 5’AU3’. Inny enzym o podobnych właściwościach to nukleaza T1 pochodząca z Aspergillus orizae, specyficzna wobec reszt guanozynowych znajdujących się w odcinkach jednociowych RNA.

Z grupy enzymów niespecyficznych wobec sekwencji można wymienić nuklazę S1 wyizolowaną z Aspergillus orizae, dwie nukleazy pochodzenia roślinnego RnI (z zarodków żyta) i ChSI (ze stromy chloroplastów pszenicy). Enzymy te specyficzne są w stosunku do jednoniociowych fragmentów RNA lub DNA. Wadą nukleazy S1 jest wymóg obecności jonów cynku w środowisku reakcji, które mogą zmieniać strukturę badanego RNA . Wady tej nie posiadają obie wspomniane nukleazy roślinne. Z kolei Rnaza T2 z Aspergillus orizae, która również jest specyficzna do odcinków jednoniciowych RNA, oraz w pewnym stopniu wykazuje preferencje do reszt adenozynowych, jest hamowana w obecności jonów metali, a szczególnie jonów miedzi.

Poszczególne enzymy różnią się od siebie warunkami, w jakich mogą hydrolizować wiązania fosfodiestrowe, czyli wartością optymalną pH oraz obecnością lub nie jonów metali. Wspomniane wcześniej sondy chemiczne wymagają określonych warunków reakcji. Nukleazy są pod tym względem bardziej tolerancyjne i pozwalają na pracę w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Ich wadą jest z kolei znaczny rozmiar, który może ograniczać dostępność niektórych regionów w cząsteczkach RNA. Aby uzyskać jak najpełniejszy obraz struktury RNA wskazane jest wykorzystanie kilku sond o różnej specyficzności.

Piśmiennictwo:

Westhof E, Masquida B, Jossinet F. Predicting and Modeling RNA Architecture. (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol 2011;3:a003632

Gilbert W. Origin of life: The RNAworld. (1986) Nature 319: 618.

Helm M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. (2006) Nucleic Acids Res 34(2):721-33; Erratum in: Nucleic Acids Res. 2007;35(20):7041.

Zuker M Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. (2003) Nucleic Acids Res 31(13): 3406–3415

Sondy chemiczne:

Purzycka KJ, Pachulska-Wieczorek K, Adamiak RW. The in vitro loose dimer structure and rearrangements of the HIV-2 leader RNA. (2011) Nucleic Acids Res 39(16):7234-48.

Sondy enzymatyczne:

Przewłocki G, Lipecka J, Edelman A, Przykorska A. New sequence-specific human ribonuclease: purification and properties. (1998) Nucleic Acids Res 26(17):4047-55.

Przykorska A, el Adlouni C, Keith G, Szarkowski JW, and Dirheimer G. Structural specificity of Rn nuclease I as probed on yeast tRNA(Phe) and tRNA(Asp). (1992) Nucleic Acids Res 20(4): 659-63.

Przykorska A, Solecka K, Olszak K, Keith G, Nawrot B, Kuligowska E. Wheat (Triticum vulgare) Chloroplast Nuclease ChSI Exhibits 5‘ Flap Structure-Specific Endonuclease Activity (2004) Biochemistry 43(35):11283-94.

Programy do przewidywania struktury RNA:

The mfold Web Serwer

Vienna RNA Package

ModeRNA – A program for comparative RNA modeling

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry