Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 27 kwietnia 2016

Liczba komentarzy: 0
Analiza mutacji metodą HRM

Codziennie odkrywane są nowe polimorfizmy, nowe mutacje, nieznane wcześniej defekty, które są sprawcami chorób dziedzicznych, nowotworowych, metabolicznych itd. Często zdarza się, że w defektywnym genie mutacje mogą wystąpić nie w jednym konkretnym locus genowym, ale być rozsiane w całej sekwencji kodującej. Jak przeprowadzić screening takiego genu bez konieczności odwoływania się do mało czułej i kosztownej techniki sekwencjonowania?

Do niedawna nie było wielkiego wyboru: mieliśmy do dyspozycji czasochłonne metody wykorzystujące różnice w mobilności elektroforetycznej w żelach poliakrylamidowych (SSCP, HD, DGGE, TGGE) oraz chromatografię dHPLC, na którą stać było niewiele ośrodków, a która także miała swoje wady.

Od kilku lat jednak rośnie konkurencja dla dHPLC: „High Resolution Melt”, bo o niej mowa, to metoda dyskryminacji różnych alleli za pomoca niewielkich różnic we wzorze krzywej topnienia matrycy po reakcji PCR. Żeby móc przeprowadzić taka reakcję potrzebny jest odpowiedni termocykler do Real-Time PCRu i barwnik niespecyficzny wiążący się wydajnie z dwuniciowym DNA.

W zasadzie HRM można wykonać nawet na SYBR Green’ie i na zwykłym termocyklerze zdolnym do odczytu flurescencji kanału zielonego. Tak to się zresztą zaczęło: ktoś zauważył, że heterozygoty posiadajace polimorfizm topią się inaczej niż sekwencje o jednym typie allelu. Nic dziwnego: kombinatoryka parowania nici DNA jest taka, że po rozpleceniu i ponownym spleceniu amplikonów u heterozygoty otrzymujemy 2 pary w pełni do siebie komplementarne i 2 pary z niesparowaniem. Matryca z takim niesparowaniem topi się znacznie łatwiej. Pytanie brzmi: co zrobić, żeby odróżnić między sobą także 2 różne homozygoty?

Z początku problem obchodzono bokiem: „spike’ując” DNA w którym mógł wystąpić polimorfizm/mutacja z pomocą DNA typu dzikiego. Dzięki temu uwidacznialiśmy drugi allel przez mismatch, ale kosztem zatracenia informacji o tym, czy mamy do czynienia z wariantem heterozygotycznym czy homozygotycznym. Ale pomyślano o nowym podejściu do tego zagadnienia i tu zaczyna się HRM…

SYBR interkaluje pomiędzy zasady dość niezgrabnie. Nie wchodzi pomiędzy nici ze 100% wydajnością, więc zdolność dyskryminacji mutacji podczas topnienia jest niska. Trzeba więc było wymyślić nowy barwnik. Znalazło się ich nawet kilka, obecnie do wyboru mamy Syto9, LC Green, Eva Green i kilka innych. Wysycają one praktycznie dsDNA, dzięki czemu dają dokładniejszy obraz topnienia DNA. To jednak jeszcze nie wystarczyło do detekcji tranzycji A/T w dłuższych niż 200pz amlikonach. Wymyślono więc, że trzeba udoskonalić odczyt fluorescencji podczas topienia matrycy. Napisano lepsze oprogramowania i zwiększono możliwości odświeżania detektorów CCD . Teraz dzięki umiejętnemu doborowi starterów można wykryć [prawie] każdą niewielką zmianę w DNA!

Jak wykonać HRM?

Potrzebujemy zwykłej reakcji PCR, jednak amplikon który w niej otrzymujemy nie powinien być dłuższy niż 200-250pz (optymalnie powinien być długości ok 100pz). Do reakcji PCR dodajemy barwnika niespecyficznego nowej generacji i całość traktujemy tak jak reakcję real-time z barwnikiem SYBR Green. Właczamy odpowiedni program z opcją HRM po skończonym Run’ie.

I tyle.

Jest i drugi sposób: wykonujemy zwykły PCR, a po skończonej reakcji dodajemy barwnika i wstawiamy naszą reakcję tylko do „stopienia” do cyklera z opcją HRM.

Trzecia opcja jest przeznaczona dla reakcji Real-Time wykonywanych w oparciu o sondy niehydrolizujące (z całą pewnością nie  TaqMan!). Taką reakcję także można pod koniec PCRu „stopić”, nazywane jest to czasami z angielska „endpoint genotyping”.

Ryciny przedstawiają wykresy topnienia dla serii próbek o sekwencji typu dzikiego (kolor zielony) oraz dla wariantu polimorficznego (krzywa pomarańczowa) i dwóch mutantów delecyjnych (krzywa czerwona i niebieska)

Analiza krzywych

Oprogramowanie dostarczane przez producentów pozwala na łatwą interpretację uzyskanych krzywych. Zadajemy software’owi zakresy normalizacji (temperatury dla których matryca jest zupełnie homogenna- niestopiona i całkowicie stopiona). Na podstawie tych wartości oprogramowanie całkuje krzywe topnienia i wylicza statystycznie szanse, że wzory dla zadanej jako kontrola próbki i próbki badanej od siebie odbiegają. Zwykle przyjmuje się 95% podobieństwa jako wartość graniczną.

Oprócz wartości liczbowej dostajemy także wykresy topnienia, które możemy porównywać.  Często takie wizualne porównanie pozwala lepiej rozróżnić próbki typu dzikiego od potencjalnych wariantów. Pozwala także na odrzucenie części fałszywych pozytywów,  które powstały np. z powodu zbyt wysokiego stężenia DNA w którejś z próbek bądź gorszą jakością matrycy.

Wady i zalety HRMu

Technika HRM jest szybka, niedroga i wygodna. Posiada jednak kilka poważnych wad.

1.  Matryca DNA musi być doprowadzona do takiego samego stężenia pomiędzy próbami i kontrolami.

2.  Żeby wykonać screening mutacji na poziomie RNA należy wcześniej wykonać ilościową ocenę badanego transkryptu (real-time PCR), a następnie rozcieńczyć matrycę tak, by doprowadzić żądany transkrypt do takiego samego stężenia pomiędzy próbami i kontrolami.

3. Metoda świetnie rozróżnia większość wariantów SNP i mutacji punktowych oraz wszystkie in/del’e. W chorobach dziedzicznych jest to łatwe, gdyż mamy do czynienia z homogenną populacją DNA, w przypadku mutacji somatycznych czułość metody jest wyższa niż sekwencjonowania, trudno więc 100% stwierdzić obecność mutacji o niskim mianie, która jednak daje nietypowy sygnał HRM

4. O ile metoda daje niewiele fałszywych negatywów, to generuje sporo fałszywych pozytywów, więc próbki dobrze jest puszczać w 2 powtórzeniach, a i to czasami nie wystarczy.

5. Im więcej próbek puszczamy jednorazowo, tym wygodniej analizuje się dane- wiemy jaki mamy rozrzut wyników dla kontroli referencyjnych i łatwiej jest zastosować odpowiedni próg odcięcia. Dlatego metoda świetnie się sprawdza przy dużych ilościach próbek, gorzej jeżeli wykonujemy analizy sporadycznie (jest to zresztą prawda dla większości metod przesiewowych).

Podsumowanie

HRM jest metodą łatwą, szybką i stosunkowo tanią. Świetnie nadaje się do analizy np. gorących ognisk mutacji („hotspots”),  mutacji w poszczególnych domenach, czy też do genotypowania (kto robi RFLP ten powinien zdecydowanie pomyśleć o zmianie metody!). Niestety ma też trochę wad, które mogą sprawić, że nie będzie nadawać się do zastosowania w naszych konkretnych badaniach. Jeżeli jednak kupujemy nowy cykler do ilościowego PCRu… czemu by nie pomyśleć o dodatkowej funkcji, skoro w zasadzie jest ona „za darmo” implementowana do sprzętu dobrych firm? Myślę że warto i że może się to w przyszłości przydać w każdym laboratorium.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry