Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 15 kwietnia 2015

Liczba komentarzy: 0
Przechowywanie próbek w biotechnologii: „jak”, „gdzie” i „jak długo”? (II)

Autor wpisu

Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych.

W części pierwszej opisałam postępowanie z tkankami i komórkami, w drugiej zaś zajmiemy się kwasami nukleinowymi.

Plazmidy i wektory

Produkty PCR i konstrukty DNA, takie jak standardy do qRT-PCR, wektory plazmidowe, fagowe czy BAC-i przechowywane są w postaci zamrożonych roztworów wodnych- w czystej wodzie lub buforach (np. TE) nawet latami bez znaczącej utraty ich właściwości. Ważne jest przechowywanie konstruktów i bibliotek w alikwotach, a nie w pojedynczych próbówkach, które będą wielokrotnie zamrażane i rozmrażane. Każda runda rozmrożenia powoduje częściową degradację DNA i stopniową utratę właściwości.

Najlepszy sposób na przechowywanie plazmidów to głębokie mrożenie w < -70 stopniach. W zasadzie nie obserwuje się utraty superhelikalnej struktury przy takim przechowywaniu.

Wygodną, ale nie tak trwałą alternatywą jest liofilizacja materiału. Uzyskany pellet może być przechowywany nawet powyżej roku czasu w temperaturze pokojowej w ciemnym pojemniku, jednak po rozpuszczeniu i elektroforezie będziemy obserwować wraz z upływem czasu stopniową utratę formy superhelikalnej do otwartej a nawet liniowej. Jeżeli zależy nam na nietkniętym plazmidzie z liofilizatu do transformacji bakterii, wówczas prowadzimy elektroforezę, wycinamy z żelu tylko formę supercoil i oczyszczamy by otrzymać nietknięte cząsteczki.

DNA genomowe

DNA to bardzo odporny na degradację materiał. Można go ekstrahować nawet z kości datowanych na kilkadziesiąt tys. lat. Jednakże antyczne DNA to bardzo kiepskiej jakości materiał- z każdym rokiem dochodzi do utleniania i hydrolizy niewielkiej ilości połączeń między zasadami DNA (najczęściej pękają wiązania diestrowe, tworząc nick’i na niciach).  Dlatego z biegiem czasu uzyskujemy coraz mniejszy plon z długich odczytów- im dłuższy amplikon, tym większa szansa na napotkanie rozciętej nici, której nie jest w stanie odczytać polimeraza.

Drugim niebezpieczeństwem jest mechaniczne, dwuniciowe pękanie nici DNA podczas cykli zamrażania-rozmrażania. Tworzenie kryształów lodu sprzyja fragmentacji łańcucha.

Trzecim zagrożeniem dla DNA jest hydroliza enzymatyczna powodowana przez DNAzy- najczęściej wydzielane są one do próbki przez mikroby, które dostały się do niej dzięki niesterylnemu przechowywaniu naszego DNA.

Żeby zapobiec niekorzystnym zjawiskom powodującym pogorszenie jakości wyizolowanego DNA, przetrzymujmy je w stanie zamrożenia (optymalnie <-70 stopni, rutynowo stosowana jest jednak temperatura zamrażalnika, ~ -20 stopni). Z doświadczenia polecam trzymać każdą próbkę w dwóch próbówkach: stężony materiał i dodatkowo rozcieńczenie robocze, które służy do oznaczeń. Jeżeli skończy się ten materiał, dopiero rozmrażam materiał stężony by przygotować nową objętość rozcieńczonego.

Jak stwierdzić częściową degradację? Elektroforetycznie (powiększenie się strefy smearu w zakresie małych fragmentów) lub za pomocą multiplex STR-PCR. W takim PCRze większe amplikony będą dużo gorzej niż zwykle amplifikowane  w stosunku do mniejszych.

RNA

RNA w przeciwieństwie do DNA jest materiałem labilny. Jest on podatny zarówno na degradację chemiczną (np. w obecności jonów 2+, kwasów lub zasad), termiczną, a przede wszystkim- enzymatyczną. RNAzy wytwarza do środowiska w dużych ilościach każdy organizm, by bronić się przed dostępem cudzej informacji genetycznej. Człowiek wydziela je z potem, śliną, łzami, śluzami- nasza skóra jest więc niebezpiecznym dla próbek RNA źródłem kontaminacji.

Przechowywanie próbek w ciekłym azocie to najlepszy sposób na zachowanie właściwości materiału pochodzenia biologicznych
Źródło: Wikimedia Commons, autor Jeffrey M. Vinocur, licencja CC BY SA 3.0
Ze względu na podatność RNA na degradację zaleca się przechowywanie tego materiału w <-70°C, krótkoterminowo w -20°C. Nie poleca się przetrzymywania tego materiału w lodówce. Temperatura pokojowa i wyższa przyspiesza hydrolizę- jeżeli zapomnieliśmy przełożyć RNA z blatu do zamrażarki, sprawdźmy je wykonując elektroforezę (oceniając jakość prążków rRNA) lub wykonajmy RT-PCR lub qRT-PCR jako kontrolę degradacji mRNA.

Piśmiennictwo:

1. Riggio B. A Beginner’s Guide to Storing Biological Materials. Bitesize Bio, 30 July 2012.

2. Ancient DNA Repair. MCMaster Ancient DNA Center, 2010.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry