Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 27 stycznia 2017

Liczba komentarzy: 5
Jak przygotować wodę wolną od RNAz (H2O-DEPC) — protokół

Woda wolna od RNAz to podstawa wszelkich manipulacji z RNA, podatnym na działanie wszędobylskich i bardzo stabilnych rybonukleaz. Wodę taką, najlepszej jakości, można zakupić u dystrybutorów większych firm sprzedających odczynniki dla biologii molekularnej. Gotowa woda ultraczysta jest niezbędna w sytuacji, gdy jakość każdej próbki jest niezwykle ważna (np. w diagnostyce medycznej), jednak w placówkach naukowych i przy zastosowaniach niekomercyjnych warto pomyśleć o własnoręcznym przygotowaniu wody do izolacji RNA. Jest to tak zwana „woda DEPC”, nazywana tak od odczynnika, który jest używany do degradacji RNAz.

Dlaczego akurat DEPC?

Dietylopirowęglan to silny środek alkilujący, któremu nie straszne są żadne białka, także bardzo stabilne i powszechne w środowisku RNAzy. Zaletą DEPC jest za to jego termolabilność i rozpad do neutralnych związków chemicznych pod wpływem autoklawowania. DEPC rozpada się  na CO2, H2O oraz etanol, który w niewielkim stężeniu nie zagraża RNA. W temperaturze pokojowej przy dłuższym przechowywaniu lub przy zbyt wysokim stężeniu dietylopirowęglan ulega przekształceniu do niższych estrów, dlatego jeżeli trąci on owocowym, estrowym zapachem, nie nadaje się już do neutralizacji nukleaz.

Przygotowanie wody wolnej od rybonukleaz:

1. Do 1 litra wody destylowanej (najlepiej zaś poddanej odwrotnej osmozie) dodaj 1ml  dietylopirowęglanu (DEPC), by otrzymać roztwór  0.1% (v/v) .

2. Dobrze wymieszaj, pozwól roztworowi odstać się w temperaturze pokojowej ok. 60-90 minut

3. Autoklawuj w standardowych warunkach (121*, 15 minut, 1 Bar)

4. Voila! Woda wolna od RNAz gotowa. Przed użyciem pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Dobrze jest przepipetować część świeżo przygotowanej wody na małe alikwoty np. do zakręcanych próbówek i zamrozić.

Uwagi:

* DEPC jest silnie toksyczny i kancerogenny (odczynnik alkilujący!), należy obchodzić się z nim ostrożnie.

* Dietylopirowęglan jest niestabilny rozcieńczony w wodzie i buforach, dlatego roztwór do autoklawowania przygotowuje się na świeżo, a przechowuje się już po sterylizacji jako czystą wodę DEPC.

 

Marzena Pieronkiewicz

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 5

  1. 1

    Do 1litra wody dodajemy 1ml 0,1% DEPC czyli 1MIKROlitr 100% DEPC? Pytam ponieważ 1ml z 1litra to 0,1% więc może to być błąd, a w innych protokołach podają, żeby zrobić 0,1% roztwór więc właśnie ten 1ml 100% DEPC.

    5 lat temu
  2. 2

    Ma Pan absolutną rację! To „chochlik drukarski”- oczywiście chodziło o dodanie 1ml czystego DEPC na litr, tak by otrzymać końcowe stężenie 0,1%! Błąd w tekście został poprawiony a Panu serdecznie dziękuję za wytknięcie tej nieścisłości!

  3. 3

    Czy przygotowując PBS mogę do niego dodać DEPC w celu wyeliminowania RNaz, czy zachodza jakieś niepożądane reakcje miedzy PBS a DEPC

    5 lat temu
  4. 4

    Dobre pytanie. TRIS jest niestety inaktywatorem DEPC, więc stosowanie go do przygotowania buforów, które mają go w składzie z 0,1% roztworem DPEC jest niewystarczające. Nie powinno się to jednak tyczy akurat PBS, bo jest to mieszanina prostych soli. Wg opracowania LifeTechnologies, które znalazłam, można efekt działania TRISu pokonać dodając 1% DEPC, ale w moim odczuciu zamiast robić bufory „depcowane” lepiej jest w sterylnych warunkach po prostu rozpuszczać gotową mieszankę soli we wcześniej przygotowanej wodzie DEPC. Przy ostrożnym traktowaniu są małe szanse kontaminacji RNAzami…
    Link do opracowania:
    http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Ambion-Tech-Support/nuclease-enzymes/tech-notes/rnase-and-depc-treatment.html

  5. 5

    Jako ciekawostke powiem, ze my po prostu dwukrotnie autoklawujemy wode mQ (standardowe warunki autoklawowania), rozpipetowanym na porcje a 5ml.
    Pracuje z ultra czystym RNA do mikromacierzy i mapowania promotorow, i nie zdazylo mi sie jeszcze, zeby mi cos zdegradowalo.
    Natomiast mam pytanie – czy ktos wie, czy depcowana woda jest znacznie czystsza pod wzgledem zawartosci RNaz od wody kilkukrotnie autoklawowanej?

    4 lata temu
  6. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry