Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 02 stycznia 2017

Liczba komentarzy: 0
Labowe „know-how” — bakterie kompetentne i transformacja plazmidowym DNA

Czy zdarzyło Ci się niepowodzenie w tak podstawowej metodzie laboratoryjnej, jaką jest transformacja bakterii obcym DNA? Ta względnie mało skomplikowana metoda potrafi czasem być na tyle kapryśna, by spędzić nam sen z powiek. Wystarczy użyć „starych” lub nie do końca kompetentnych bakterii lub zastosować zbyt wysokie ilości DNA, aby na drugi dzień zamiast pięknych kolonii zobaczyć czyste szalki. Zaoszczędź sobie tej frustracji i użyj sprawdzonego przepisu, który przedstawiam poniżej:

 

 

  1. 1. Przygotowanie chemicznie kompetentnych E. coli

 

(przed rozpoczęciem procedury przygotuj około 25 ml  sterylnego 50 mM CaCl2 i schłódź go w lodówce)

 

  • zaszczep 1 ml pożywki (LB lub BHI) odpowiednim szczepem E.coli (np. DH5α, TOP10)
  • hoduj przez noc w 37 st. z wytrząsaniem (~ 16 h)
  • zaszczep 40 ml pożywki 1 ml kultury nocnej i hoduj w 37 st. z wytrząsaniem (sprawdzaj regularnie OD600)
  • gdy OD600 = 0,2 – 0,25 zakończ hodowlę i przetrzymaj bakterie na lodzie przez 15 min
  • zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
  • rozpuść pelet bakteryjny w 20 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
  • inkubuj 20 min na lodzie
  • zwiruj hodowlę (5 000 rpm, 10 min, 4 st.)
  • rozpuść pelet bakteryjny w 1 ml zimnego CaCl2 (50 mM)
  • inkubuj około 30-40 min na lodzie
  • po tym czasie bakterie są gotowe do użycia

Uwaga! Bakterie pozostaną kompetentne przez następne 2-3 dni jeśli przechowasz je w lodówce (nie dłużej!) Możesz również przechować je przez dłuższy czas (2-3 miesiące) w -80 st.

 

  1. 2. Transformacja bakterii kompetentnych metodą „heat shock”

 

  • przygotuj porcję chemicznie kompetentnych bakterii (50-100 µl)
  • zmieszaj bakterie z wektorem, który chcesz wprowadzić – użyj około 10-30 ng plazmidowego DNA zawieszonego w wodzie
  • inkubuj 30-45 min na lodzie
  • przełóż próbkę na 90 sek do 42 st. („heat shock”)
  • przełóż bakterie z powrotem na lód (5 min)
  • dodaj 250 µl pożywki (LB, BHI lub SOC) – możesz ją wcześniej ogrzać do 37 st.
  • hoduj przez 30-40 min w 37 st. z wytrząsaniem
  • posiej około 100 µl zawiesiny na płytki selekcyjne
  • hoduj przez noc w 37 st. (lub przez weekend w temperaturze pokojowej, jeśli doświadczenie wypadło na piątek..)

— uważaj, żeby nie doprowadzić do przerośniecia kolonii, gdyż w takim wypadku poszczególne klony mogą zrosnąć się ze sobą!

  • — wyrosłe kolonie powinny posiadać obce DNA; możesz sprawdzić to metodami Colony PCR, czy Rapid Colony Screening lub wyizolować plazmid z pojedynczej hodowli (po jej uprzednim rozhodowaniu) i zsekwencjonować.

Uwaga! Pamiętaj, aby posiać również kontrolę negatywną (bakterie nietransformowane), dzięki której sprawdzisz, czy antybiotyk w podłożu nie uległ rozkładowi.

Pamiętaj również, że podłoża stałe z antybiotykiem pomimo tego, że przechowywane są w lodówce nie nadają się do użycia po kilku miesiącach, gdyż antybiotyk ulega rozkładowi. Jeśli w Twoich bakteriach nie ma wprowadzonego DNA (pomimo obecnych transformantów) może być to wina „starych” szalek.

AM

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry