Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 26 stycznia 2015

Liczba komentarzy: 0
Protokół FISH na EGFR

W jaki sposób wykonać FISH? Do analizy techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) wykorzystujemy w naszym laboratorium zatopione w parafinie fragmenty tkanki. Tkanki kroimy cienko (5 mikronów) i poddajemy procedurze odparafinowania w ksylenie, a następnie trawimy i utrwalamy jądra komórkowe. Czasy trawienia (25 lub 30 minut) dobieramy w zależności od preparatu tak, aby uzyskać dobrą jakość hybrydyzacji, ale bez nadmiernego uszkodzenia jąder komórkowych.

Na tak przygotowane preparaty nakładamy sondę i po pięciominutowej denaturacji DNA przeprowadzamy hybrydyzację przez 21 godzin w hybrydyzatorze (u nas stoi tani, całkiem przyzwoity MP16 Genos-Hiperon, Polska) w 37°C.

Następnego dnia nadmiar niezhybrydyzowanej sondy odpłukujemy, a jądra komórkowe uwidoczniamy dzięki zastosowaniu barwnika DAPI – specyficznego dla DNA, barwiącego jądra komórkowe. Preparaty obserwujemy pod mikroskopem fluorescencyjnym

Dokładna procedura stosowanej metody zamieszczona jest poniżej:

Odparafinowanie tkanek

1. Preparaty umieścić w ksylenie I na 10 minut.

2. Przenieść do ksylenu II na 10 minut.

3. Umieścić w etanolu 100% na 5 minut – 2x.

4. Przenieść do szeregu etanolowego: 95%, 80%, 70% po 2 minuty, po czym wysuszyć.

Przygotowanie – procedury poprzedzające trawienie:

5. Preparaty umieścić w 0,2N HCl na 20 minut.

6. Płukać w wodzie destylowanej przez 3 minuty.

7. Płukać w Wash Buffer przez 3 minuty.

8. Przenieść do Pretreatment Solution o temp. 80°C na 30 minut.

9. Płukać w wodzie destylowanej przez 1 minutę (delikatnie).

10. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut – 2x.

11. W międzyczasie rozpuścić proteazę (25mg, gotowy proszek) w Protease Buffer (37°C).

Trawienie proteazą

12. Preparaty wyjąć z Wash Buffer, odsączyć nadmiar buforu i wysuszyć.

13. Trawić w roztworze proteazy w 37°C przez 25-30 minut.

14. Płukać w Wash Buffer przez 5 minut – 2x, po czym wysuszyć na powietrzu.

Hybrydyzacja

15. Na preparaty nałożyć po 10 ul sondy. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm) i zakleić.

16. Po wysuszeniu kleju preparaty umieścić w hybrydyzatorze.

Program: denaturacja (72°C,5 minut), hybrydyzacja: (37°C, 21 godzin).

Płukanie po hybrydyzacji (na następny dzień)

17. Preparaty zanurzyć na około 10-15s w Post Hybridization Buffer w temperaturze pokojowej, po

czym usunąć szkiełko nakrywkowe.

18. Preparaty umieścić w Post Hybridization Buffer w 72°C na 2 minuty.

19. Po wysuszeniu nałożyć po 10 ul DAPI i przykryć szkiełkami nakrywkowymi.

Preparaty należy przechowywać w ciemności,  w -20°C.

W badaniu genu EGFR metodą FISH my używamy sondy Vysis LSI EGFR (Abbott Molecular) komplementarną do regionu 300kb chromosomu 7, obejmującego całą sekwencję genu EGFR. Sonda jest wyznakowana barwnikiem Spectrum Orange, który daje w mikroskopie fluorescencyjnym sygnał pomarańczowy. Dodatkowa kontrolna sonda CEP7 wiąże się z alfa satelitarnym DNA w rejonie centromerowym chromosomu 7 (7p11.1-q11.1), na którym zlokalizowany jest gen EGFR. Dzięki barwnikowi Spectrum Green sonda ta świeci na zielono. Pozwalało to na zweryfikowanie otrzymanego sygnału i wykluczenie potencjalnych artefaktów. Obie sondy znajdują się w dostarczonym od producenta i gotowym do użycia buforze hybrydyzacyjnym.

Wynik FISH dla sondy Vysis LSI EGFR. Widać wyraźnie 3n dla 7 chromosomu
Źródło: opracowanie własne

Przygotowane preparaty oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym (Leica) i sprawdzamy ilość sygnałów pomarańczowych i zielonych w poszczególnych komórkach. Zliczanie sygnałów w pojedynczych komórkach jest możliwe dzięki dodatkowemu wybarwieniu jąder specyficznym dla DNA barwnikiem DAPI (niebieski). W przypadku prawidłowej liczby kopii genu EGFR i chromosomu 7 obserwuje się dwa pomarańczowe i dwa zielone punkty. Z kolei obecność trzech lub więcej sygnałów pomarańczowych wskazuje na zwiększoną liczbę kopii genu przy zachowaniu prawidłowej liczby chromosomów 7.

M.Z.

Piśmiennictwo:

Własne doświadczenie zawodowe

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry