Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 10 kwietnia 2015

Liczba komentarzy: 0
Przechowywanie próbek w biotechnologii: „jak”, „gdzie”, i „jak długo”? (I)

Temat archiwizacji próbek jest istotny zarówno dla naukowców, jak i dla klinicystów. Czy to podczas realizacji projektu badawczego, czy to do późniejszego wykorzystania, wreszcie- dla celów terapeutycznych. Dla niektórych typów materiałów istnieje consensus co do sposobu przechowywania, natomiast dla innych nie ma żadnych konkretnych wytycznych i tylko od załogi laboratorium i posiadanego sprzętu zależy, jak i czy w ogóle jest on bankowany.

W części pierwszej zajmiemy się materiałami tkankowymi i komórkowymi.

Żywotne hodowle komórkowe eukariotyczne, gamety i komórki macierzyste

Zachowanie w dobrej kondycji wrażliwych, osłoniętych jedynie błoną plazmatyczną komórek zwierzęcych jest nie lada wyzwaniem. Oczywiście zatrzymanie ich metabolizmu jest możliwe jedynie poprzez zamrożenie, jednak woda podczas mrożenia tworzy kryształy, które niczym włócznie przebijają na wskroś mrożone komórki. Dlatego procedura mrożenia jest bardzo ściśle określona i wymaga specjalistycznej aparatury.

Komórki przed mrożeniem są delikatnie traktowane, odpłukiwane z medium hodowlanego, zastępowanego  roztworem zawierającym krioprezerwant (najszerzej używanym jest DMSO, chociaż wybór środka zależy od typu komórek). Jego funkcją jest nie dopuścić do tworzenia się kryształów i  do nadmiernego obkurczania się komórek w stanie zamrożenia.

Samo zamrażanie musi być na tyle szybkie, żeby komórki nadmiernie się nie obkurczyły, ale na tyle wolne, by nie doprowadzić do ich lizy. Komórki ssacze najczęściej poddaje się mrożeniu z szybkością 1-3 stopni Celcjusza na minutę, schładzając je docelowo do temperatury poniżej -130 stopni.

Jest jeszcze druga technika zamrażania, zwana witryfikacją, czyli zeszkleniem. Polega ona na tak szybkim zamrożeniu komórek, by ich roztwór zamienił się nie w kryształy lodu, ale w amorficzne ciało stałe podobne do szkła. Odbywa się to poprzez nagłe włożenie do ciekłego azotu i nadanie ruchu próbce podczas zamrażania, tak by ciekły azot maksymalnie szybko odbierał jej ciepło.

Krioprezerwacja to powszechna metoda przechowywania komórek i ekstraktów białkowych w celu zachowania ich funkcji biologicznych
Źródło: Wikimedia Commons, autor Jeffrey M. Vinocur, licencja CC BY SA 3.0
Przechowywanie po zamrożeniu odbywa się albo nad ciekłym azotem, w jego parach (-140 do -180 stopni), albo w cieczy (-196).

Rozmrażanie komórek polega najczęściej na raptownym rozgrzaniu do 37 stopni i szybkim odpłukaniu środka konserwującego, by nie dopuścić do zatrucia komórek i szoku osmotycznego.

Materiał roślinny pochodzący z zawiesin komórkowych mrozi się w podobny sposób.

Żywotne linie bakteryjne i drożdżowe

Bakterie i drożdże, z racji mniej skomplikowanego metabolizmu, naturalnych przystosowań do trudnych warunków środowiska i posiadania ściany komórkowej, łatwiej jest zachować przy życiu w stanie zamrożenia.  Oczywiście są mikroby wrażliwe, wymagające odpowiedniego przygotowania przed krioprezerwacją, jednak poczciwa E. coli, czy S. cerevisiae, jak ii wiele innych gatunków nie wymagają skomplikowanych procedur.

Kolonie w fazie wzrostu logarytmicznego (nigdy w fazie stacjonarnej ani obumierania!) zawirowuje się i zawiesza w 15% roztworze glicerolu. Voila, teraz po prostu nasze bakterie przechowujemy w -20 stopniach.

Do krótkotrwałego przechowywania (kilkudniowego) można wykorzystać schładzane w lodówce szalki lub skosy agarowe, czasami także podłoża płynne.

Istnieje także możliwość wysuszenia naszych mikroogranizmów z zachowaniem częściowej żywotności (nawet >50%) przy użyciu specjalnej aparatury do sublimacji. W zamrożeniu z kultur odparowywana jest woda, dzięki czemu otrzymujemy liofilizat, który może być przechowywany przez długi czas w zamrożeniu czy też nawet w temperaturze pokojowej  bez dostępu wody. Tą technologią suszone są dobrej jakości drożdże piekarskie i winiarskie, które kupujemy w saszetkach w sklepach spożywczych.

Ekstrakty komórkowe

Ekstrakty komórkowe nie muszą być utrzymane przy życiu, dlatego istnieje wiele sposobów na ich przechowywanie.

Jeżeli zależy nam jedynie na materiale DNA lub plazmidowym, można po prostu zawiesinę lub tkankę zamrozić w buforze. Mniej kłopotliwe w transporcie są liofilizaty, które bez dostępu wody można przechowywać w temperaturze pokojowej lub w lodówce.

Do otrzymania lizatów o jakości wystarczającej do badań białek należy się bardziej przyłożyć. Jeżeli nasze eksperymenty zakładają użycie zdenaturowanych polipeptydów- nie ma większego problemu, wystarczy inhibicja proteolizy i zamrożenie lizatu. Jeżeli natomiast potrzebne nam są białka natywne, postępujemy z reguły tak, jak z hodowlami komórkowymi- zawieszamy lizat w odpowiednim buforze (zawiera inhibitory proteaz, chelatory i/lub krioprotektanty), następnie zanurzamy w ciekłym azocie i przechowujemy w co najmniej -70 stopniach. Jeżeli białka które badamy są  stabilne (np. kolageny) lub występują w dużych ilościach w komórce (albuminy, kazeina), możemy spróbować liofilizacji jako tańszej i mniej kłopotliwej alternatywy.

Przechowywanie krótkoterminowe w lodówce, od kilku dni do nawet miesiąca czasu jest możliwe przy zastosowaniu buforów zawierających substancje bakteriobójcze i inhibitory proteaz.

Wycinki tkankowe i bioptaty

Konserwacja skrawków do badań histopatologicznych jest standardowo wykonywana w pracowniach patologii i polega na maceracji wycinka tkankowego w zbuforowanym roztworze 10% formaliny, następnie zaś zatopieniu skrawka w kostce parafiny. Tzw. „bloczki” parafinowe można przechowywać latami bez dużej straty właściwości biologicznych. O ile RNA w takich kostkach ulega szybkiej lizie, o tyle chromatyna jądrowa i większość białek (aczkolwiek te częściowo denaturują) pozostaje nietknięta. Możliwe jest więc prowadzenie analiz retrospektywnych na DNA (techniki biologii molekularnej i FISH) oraz badań immunohistochemicznych i histochemicznych. By przygotować preparat mikroskopowy i wybarwić tkankę należy z bloczka odciąć na mikrotomie odpowiednie skrawki, „odparafinować” je i wybarwić.

Krótkotrwałe (kilka dni lub tygodni) przechowywanie preparatów tkankowych możliwe jest w zbuforowanym roztworze formaliny.

Rozmazy cytologiczne

W zależności od typu rozmazu (szpik i krew obwodowa, materiał z biopsji aspiracyjnych BAC, cytologia ginekologiczna, rozmazy płynów wysiękowych itd.) stosuje się różne techniki wykonywania rozmazów i różne barwienia. Przechowywanie takich rozmazów polega w dużym uogólnieniu na przygotowaniu niebarwionych szkiełek z naniesionym odpowiednio materiałem w kilku (co najmniej 2) powtórzeniach, dobrym osuszeniu szkiełek, a następnie archiwizacji ich w suchym i ciemnym pomieszczeniu. Materiał utrwalony na szkiełkach zwykle nadaje się do barwień cytochemicznych, czasami możliwe jest otrzymanie małych ilości DNA z takich próbek do badań molekularnych, ale jest ono znacznie gorszej jakości (i w mniejszej ilości) niż z bloczków parafinowych. Różnie bywa z oznaczeniami białek:  są one często mocno zdenaturowane i mogą nie wykazywać właściwości antygenowych niezbędnych np. do immunolokalizacji przeciwciałami mono, a nawet poliklonalnymi.

Preparaty barwione niektórymi barwnikami strąceniowymi można przechowywać w ciemnym pomieszczeniu przez dłuższy czas, jednak część barwień bleknie już po kilku dniach (np. FAG) lub tygodniach (barwienia immunofluorescencyjne, np. FISH)

Jądra komórkowe do techniki FISH

Do badań cytogenetycznych wykorzystuje się bioptaty tkankowe lub świeże zawiesiny komórkowe. Gdy nie jest możliwe wykonanie badania FISH od razu, lub gdy zaistnieje potrzeba przechowania prób pochodzących z zawiesiny komórek (np.w onkologii), można je przechować w dwojaki sposób: albo w postaci utrwalonych, niewybarwionych szkiełek przechowanych w < -70  stopniach, lub jako zawiesina komórek utrwalona w mieszaninie metanol-kwas octowy, przechowywana w zamrożeniu. Bardziej polecana jest ta druga metoda, gdyż materiał po wykonaniu FISHa jest lepszej jakości niż po nałożeniu na gotowe, przemrożone szkiełka.

Co do skrawków parafinowych do FISH, postępowanie nie różni się od tego opisanego w punkcie 4.

Piśmiennictwo:

1. Riggio B. A Beginner’s Guide to Storing Biological Materials. Bitesize Bio, 30 July 2012.

2. El-Danasouri I., Selman H. Vitrification versus conventional cryopreservation technique. MEFSJ, Bioline, 2005, 10, 3: 205-206.

3. Millipore technical publications: Cell Lysate Extracts-General Protocols, 2007.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry