Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 26 listopada 2016

Liczba komentarzy: 5
Przygotowanie liniowych standardów do reakcji Real-Time PCR (protokół)

Niejednokrotnie zdarza się, że projektujemy własną metodykę opartą o technikę Real-Time PCR. Największym problemem przy optymalizacji gotowej metody, zarówno na etapie badań naukowych, jak i standaryzacji oraz komercjalizacji, jest przygotowanie odpowiednich standardów.

Jak zrobić to najprościej?

Krzywe standardowe przygotowuje się zwykle na bazie plazmidów- kolistych lub linearyzowanych (poprzez cięcie restrykcyjne). Pokutuje teoria, że takie cząsteczki zachowują się podczas Real-Time PCRu tak samo jak mieszanina różnych cząsteczek we właściwej reakcji z cDNA, podczas gdy reamplifikacja produktu PCR ma inną kinetykę niż właściwego cDNA, przez co ilościowanie jest zafałszowane.

Niewielu zdaje sobie sprawę, że jest to mit. Zamiast linearyzowanych cząsteczek plazmidu wystarczy użyć produktu PCR namnożonego na „szerszych” starterach, niż startery używane podczas właściwej reakcji ilościowej.

Oto prosty przepis na standardy:

*    Zaprojektuj specyficzny, dobrze działający PCR na starterach zewnętrznych względem starterów użytych do Real-Time’u o ok. 100-200nt z każdej strony (patrz rycina)

*    Zamplifikuj dużą ilość matrycy na zewnętrznych starterach. Oczyść produkt na kolumienkach, pozbywając się zanieczyszczeń i buforu reakcyjnego. (KITy do oczyszczania produktu PCR oferowane są na polskim rynku przez wiele firm)

*    Zmierz przy pomocy Nanodropa lub innego spektrofotometru stężenie matrycy wobec buforu użytego do elucji produktu PCR.

* Przelicz stężenie według poniższego wzoru:

Liczba kopii w 1ul  Lk =(x  * 6.022×1023)/(długość matrycy w pz*1×109 * 650), gdzie x to wartość stężenia wyrażona w ng/ul. Żeby zrobić to szybko i bez pomyłek, użyj gotowego kalkulatora

*    Rozcieńcz standard w dowolny sposób. Pierwszego stężenia przygotuj tyle, żeby starczyło go na wszystkie eksperymenty, jeżeli zabraknie go, należy kolejny batch pierwszego standardu wywzorcować w Real-Time PCR z uwzglęnieniem standardu używanego wcześniej!

 

Przykład:

*    Produkt Real-Time PCRu ma 223 pz. Zewnętrzne względem nich  startery mają 580pz.

*    Po amplifikacji i sprawdzeniu na żelu agarozowym jakości i wysokości prążka (silny, wąski prążek produktu o wielkości ~580pz) oczyszczamy próbkę na żelu.

*    Zmierzone stężenie wynosi 26ng/ul.

*    Wstawiamy wartości 26 i 580 w odpowiednie miejsca kalkulatora (lub liczymy ręcznie).

Wyliczona wartość to 4,15×10^10

*   Żeby przygotować kolejne rozcieńczenia pipetujemy np. po 90ul H2O (lub buforu do elucji, zależy czym eluowaliśmy) do kolejnych próbówek, po czym do pierwszego rozcieńczenia dodajemy 10ul. Przygotowanego standardu, vortexujemy, następnie do 2-go standardu 10ul pierwszego itd. Podczas Real-Time’u definiujemy kolejne stężenia jako 4,15×10^10,  4,15×10^9,  4,15×10^8 itd.

 

Uwagi dotyczące metody:

Metoda obliczenia opiera się na założeniu, że średnio mol 1 pary zasad waży 650g (czyli 1 para zasad 650 Daltonów). Oczywiście można obliczyć dokładną wagę naszej matrycy, używając skryptu zliczającego ilość par GC i AT, mnożąc to następnie przez ich wagę, ale doświadczenie podpowiada, że jest to niepotrzebne.

Stężenie oczyszczonego produktu PCR mierzone spektrofotometrycznie także nie jest bardzo dokładne, ale jeżeli amplifikacja poszła dobrze, taka dokładność wystarcza. Jeżeli zmierzone stężenie produktu jest mniejsze niż 10ng/ul (czyli mocno zawyżone z powodu bliskiego poziomu tła), polecam powtórzyć amplifikację, to na pewno lepsze niż powtarzanie całej procedury przygotowania standardów, jeżeli okazałoby się że ilościowy PCR nie chodzi przy 10 czy też 100 kopiach na reakcję.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 5

  1. 1

    Czy wilekim błędem jest użycie tych samych starterów do amplifikacji matrycy i Real Time PCR ?

    6 lat temu profil
  2. 2

    Podczas reamplifikacji reamplifikacji w znakomitej większości przypadków kinetyka reakcji wygląda inaczej niż podczas amplifikacji z cDNA. Dłuższe matryce z wolnymi końcami zwykle posiadają na tyle podobną krzywą amplifikacji do cDNA, że nie zmienia to wartości Ct (acz nie zawsze!). Najprościej przekonać się o różnicach kinetycznych podczas reamplifikacji porównując w 1 rzucie wykresy amplifikacji dla obu typów reakcji. Jeżeli przebieg krzywych w przebiegu liniowej części reakcji nie jest równoległy, to taki standard się nie nadaje.

  3. 3

    Dziękuje bardzo za odpowiedź, mam tylko jeszcze małe pytanie co miała Pani na myśli pisząc w 1 rzucie ?

    6 lat temu profil
  4. 4

    Razem. W sensie równolegle… z jednego mixu, podczas tej samej amplifikacji 🙂

  5. 5

    Zamiast się w to bawić nie lepiej wykorzystać do analizy program LinRegPCR pozwalający na obliczenie wydajności każdej poszczególnej reakcji..

    6 lat temu
  6. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry