Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 15 maja 2012

Liczba komentarzy: 1
Real-Time PCR (IV): Pomiar względny i bezwzględny ilości kopii

Ilościowy PCR znajduje zastosowanie w różnych sytuacjach:  pozwala oszacować ilość kopii matrycy, porównać kilka różnych próbek pod względem różnic w ilości kopii  albo orzec o zmianie ilości cząsteczek  matrycy w czasie. Pierwsze zastosowanie wymaga innej strategii postępowania niż dwa kolejne: możemy tu mówić o ilościowaniu bezwzględnym i względnym. Co wyróżnia oba podejścia i gdzie konkretnie maja zastosowanie?

1. Co decyduje o przyjętej formie pomiaru ilości kopii?

Decyzja o sposobie pomiaru jest podyktowana zastosowaniem wykonywanego przez nas oznaczenia. Pomiar bezwzględnej liczby kopii jest stosowany w sytuacji, gdy zależy nam nie tylko na określeniu zmian w ilościach produktu np. w czasie kilku eksperymentów, czy też na wykazaniu różnic w ekspresji genu pomiędzy próbami, ale także na konkretnej, bezwzględnej wartości liczbowej. Jest to trudniejsze, gdyż wymagane jest wybranie standardów o ściśle określonej ilości kopii i bardzo zbliżonej kinetyce reakcji co próbka badana. Oznaczenia bezwzględne wykonywane są dlatego rzadziej, służą np. do: szacowania ilości mikroorganizmów w żywności, pomiaru ilości GMO w produktach spożywczych czy też  poziomu wiremii w diagnostyce wirusologicznej.

2. Pomiar bezwzględnej ilości transkryptu

Pomiar bezwzględny dokonywany jest przez porównanie wartości Ct próbki z krzywą kalibracyjną,  wykreśloną na podstawie standardów o dokładnie znanym stężeniu. Nie jest wymagany żaden gen referencyjny, bo nie potrzebujemy obliczać poziomu ekspresji względem niczego, potrzebujemy określonej wartości liczbowej, zależnej tylko od zawartości żądanej matrycy w naszej próbce i od wielkości próbki pobranej do badania z większej całości (stosujemy więc konkretną  jednostkę, np. kopie genomu na ml surowicy). W ilościowaniu GMO stosuje się bardziej zaawansowana strategię podobną raczej do względnego pomiaru ilości matrycy: wykonuje się 2 pomiary bezwzględne (jeden dla ilości markera GMO, drugi dla ilości genomów), po czym wyznacza się wartość procentową (genomy GMO/wszystkie genomy *100% lub wagowo: ilość gramów GMO na gram biomasy roślinnej).

3. Pomiar względnej ilości transkyptu

Pomiar względny ilości kopii opiera się na założeniu, że informacja o zmianie stosunku ilościowego pomiędzy dwoma parametrami jest wystarczająca dla naszego eksperymentu. Tę strategię stosuje się podczas obserwacji zmian ekspresji w czasie, porównywania ekspresji pomiędzy próbami oraz np. przy pomiarze tzw. obciążenia mutacją i szacowaniu ilości kopii genu w genomie.

Żeby przeprowadzić taki pomiar potrzebujemy próby odniesienia. Może nią być:

-gen referencyjny o stałej ekspresji, tzw. housekeeping gene, czyli kontrola endogenna

-sztucznie wprowadzona z zewnątrz cząsteczka kwasu nukleinowego (tzw. „spike”), czyli kontrola egzogenna

-indeks referencyjny będący średnią z kilku genów referencyjnych

-średni poziom genu badanego, otrzymany przez uśrednienie wszystkich pomiarów dla genu badanego

Ilościowanie prowadzone jest poprzez porównanie wartości Ct pomiędzy próbą badaną a naszą próbą odniesienia.  Wartość jaką otrzymujemy nie posiada jednostki i informuje nas jaka jest ilość kopii amplikonu w odniesieniu do kalibratora.

Można takie wartości ze sobą porównywać dzięki zastosowaniu pewnych wzorów matematycznych, np. po to aby:

-porównać naszą próbkę z niestymulowana kontrolą

-zobaczyć jak zmienia się ekspresja w czasie w stosunku  do próbki zmierzonej w czasie  T0

-zmierzyć różnice między zdrową populacją a stanami chorobowymi

-porównywać wyniki pacjenta w kilku laboratoriach diagnostycznych.

 

W kolejnej części cyklu zajmiemy się w szczegółach sposobami normalizacji wyników Real-Time PCR.

qPCR

 

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    bardzo przydatne wykłady, rowiązują wiele wątpliwości pozostałych po podręcznikowych „sztywnych” definicjach. czekam na więcej 🙂

    5 lat temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry