Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 14 maja 2016

Liczba komentarzy: 0
Tęcza w próbówce: jak dobierać barwniki sond w reakcjach multiplex?

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Jeżeli projektujecie reakcje Real-Time PCR (szczególnie pośredniego ilościowania), warto zastanowić się nad wersją multiplex: zastosowanie kilku par starterów  i sond jest najwygodniejszym, najszybszym i najbardziej precyzyjnym sposobem na ilościową ocenę kilku transkryptów. Pojawia się jednak istotny problem: jakie barwniki do sond będą najbardziej odpowiednie?

Każdy z barwników posiada specyficzne spektrum absorpcji i  emisji fali świetlnej.  Fluorescencja jest skutkiem wybicia niosącego wysoką energię elektronu z cząsteczki barwnika i emisji części pochłoniętej podczas tego procesu energii. Cząsteczka barwnika pochłania odpowiedni kwant światła o wyższej energii (absorpcja), a po wybiciu elektronu emituje kwant o niższej energii (emisja). Od struktury cząsteczki i rozkładu powłok elektronowych  zależy, jak duża porcja energii musi być dostarczona- dlatego różne barwniki wymagają odmiennych długości fali świetlnej (niosących różną energię) do wzbudzenia.

Dobór odpowiedniego zestawu barwników, których spektra emisji i absorpcji jak najmniej się pokrywają, jest bardzo istotny: pozwala na minimalizację tła i nie prowadzi do niespecyficznego odczytu fluorescencji. W sieci dostępne jest kilka zestawień, które ułatwiają dokonanie wyboru, jednak w żadnym z nich nie ma  pełnej gamy barwników, oferowanej obecnie na rynku. Poniżej przedstawiam kilka takich zestawień.

1. Multiplexing qPCR recomendations, Biosearch Technologies

Moja ulubiona aplikacja do wyboru sond. Z jednej strony mamy możliwość przejrzenia tabeli sond oferowanych przez BT, idealnych dla danego termocyklera, z drugiej możemy sami zestawić niemal dowolnie spektra absorpcji i emisji dwudziestu barwników, które zostały wprowadzone do bazy aplikacji „Spectral Overlay Chart„.

2.  Qiagen Multiplex Real-Time PCR Resource Center

Qiagen opublikował na swojej stronie ciekawe poradniki dot.  multiplex RQ-PCRu, jednak najprzydatniejsza jest tabela zestawień barwników w kombinacjach pod dany termocykler.  Mamy tu większy wybór niż w przypadku tabeli BT.

3. Zestawienie sond Genomedu

Ciekawe zestawienie 74 kombinacji barwnik-quencher, porównujące chyba wszystkie potrzebne nam parametry. Wygodna zakładka w lewym górnym rogu pozwala „odsiać” tylko te sondy, które zawierają interesujący nas barwnik lub quencher. Estetycznie i kolorowo.

Wybór sondy do qPCR może być nie lada wyzwaniem, zważywszy na szeroki ich wybór na rynku.

 Jakie znaczenie ma wybór odpowiednich barwników?

Pytanie na pozór proste, wcale takie nie jest. Przede wszystkim musimy wiedzieć, jakie kanały fluorescencji odczytuje nasz termocykler. Ta podstawowa informacja powinna znajdować się w opcjach oprogramowania oraz w instrukcji urządzenia.  W starszych termocyklerach mieliśmy do wyboru np. tylko 2 kanały (zielony pod FAM i SYBR i żółty pod JOE). Obecnie większość cyklerów ma możliwość odczytu co najmniej 5 kanałów, co daje nam prawie nieograniczoną dowolność w doborze kolorów.

Ważne są także długości fali wzbudzenia i emisji lasera naszego urządzenia. Warto wybierać takie barwniki, których maksima absorpcji/emisji są zbliżone do wartości zdefiniowanych w cyklerze. W tej materii przychodzą nam z pomocą  wspomniane wcześniej tabele.

Pozostaje jeszcze kwestia quencherów: skąd mamy wiedzieć, jaki „wyciszacz” będzie najlepszy dla sond typu FRET, jeżeli mamy do wyboru kilka z nich? Żeby odpowiedzieć sobie na to pytanie zapoznajmy się ze spektrum absorpcji quenchera i spektrum emisji barwnika fluorescencyjnego. Idealny quencher absorbuje na tych samych długościach fali, na których barwnik emituje.

Ostatnia z uwag dotyczących barwników:  nie wszystkie barwniki są tak samo wydajne jeśli chodzi o fluorescencję. Np. sondy oparte o  FAM w porównaniu z  większością „nowoczesnych” barwników (w sondzie o tej samej sekwencji i stęzeniu) mają ponad dwukrotnie niższą fluorescencję. Nie jest to problemem, musimy jednak zoptymalizować tzw. „gain” w opcjach oprogramowania cyklera (dla danego barwnika i dla danej reakcji)  który pozwoli nam do pewnego stopnia znormalizować różnice we fluorescencji różnych barwników.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry