Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 24 lutego 2016

Liczba komentarzy: 1
Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! Jak się przed nimi bronić? (I)

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie pracowników laboratorium w koszmar na długie tygodnie. Jak nie dopuścić do tej sytuacji? Przedstawiam Wam rozwiązania, które uchronią Was przed fałszywymi pozytywami i oszczędzą mnóstwa frustracji.

1. GLP przede wszystkim

Niestety nie istnieje rozwiązanie, które pozwoli nam zupełnie beztrosko poczynać sobie z produktami PCR w laboratorium. Podstawą każdej czynności, począwszy od pipetowania, skończywszy na usuwaniu odpadów, musi być dobra praktyka laboratoryjna i należy mieć tego pełną świadomość. Zacznijmy od najważniejszego: myślmy nad każdą wykonywaną czynnością. Niech nie zgubi nas rutyna!

*     Aby nie dopuścić do kontaminacji, spróbujmy rozdzielić przestrzennie czynności wykonywane w laboratorium. Przypiszmy pipety do poszczególnych stanowisk laboratoryjnych i nie wychodźmy z nimi poza obszar roboczy, do którego są przyporządkowane.

*     Pilnujmy tipsów- czy nakładane są do pudełek w innym miejscu niż wykonujemy PCR? Czy personel który to robi, używa zawsze świeżych rękawic? Czy pudełka na tipsy są zamykane, gdy z nimi nie pracujemy?

*     Uważajmy na standardy do Real-Time PCRu i próbówki z produktami reakcji. Kwestia warta rozważenia: jeżeli w każdym mikrolitrze standardu jest sto milionów kopii matrycy, to co się stanie, jeśli taki mikrolitr kapnie nam na stół a następnie zostanie roztarty przez sprzątaczkę ścierką po całym blacie? Albo gdy kapnie nam na rękę, którą następnie złapiemy za pipetę, klamkę lub mikropłytkę?

*     Zachowujmy szeroko rozumiany porządek wokół siebie

*     Dbajmy o reagenty: gdy to tylko możliwe, pipetujmy duże objętości na małe alikwoty do jednorazowego użytku. Zmieniajmy tipsy dodając po sobie kolejne reagenty. Nigdy nie przelewajmy resztek z jednej buteleczki do drugiej, bo możemy zepsuć kolejną partię odczynnika lub buforu!

2. Odpowiednie pomieszczenia laboratoryjne są na wagę złota

Jeżeli planujemy dopiero rozkład pomieszczeń laboratoryjnych, od początku miejmy na uwadze, że będziemy wykonywać w tych pomieszczeniach rożne etapy naszej pracy. Oddzielenie przestrzenne PCRu od reszty zadań laboratoryjnych jest najłatwiejszą i najskuteczniejszą bronią w walce z kontaminacją. Walczmy o każdą piędź ziemi z tymi, którzy finansują przedsięwzięcie, bo im więcej zainwestujemy w pomieszczenia, tym mniej stracimy na powtarzaniu nieudanych reakcji. To się zwróci- nie od razu, ale z cała pewnością.

*     Pomieszczenie, w którym będziemy trzymać nowe odczynniki, przygotowywać MIXy i bufory, DEPCować wodę, powinno być jak najbardziej oddalone od reszty pomieszczeń. Jest to pomieszczenie czyste.

*     Drugie pomieszczenie, które powinno oddzielać część brudną od czystej, to pomieszczenie biurowe/socjalne/sala komputerowa- miejsce na dokumentację, seminaria, pracę z komputerem itp. W nim w ogóle nie powinny znajdować się próbki ani reagenty.

*     Trzecie pomieszczenie to pomieszczenie brudne do preparatyki próbek. Ideałem byłoby, gdyby odbywała się tam tylko wstępna preparatyka próbek, izolacja DNA i RNA, ewentualnie katalogowanie i mrożenie analitów.

*     W ostatnim pomieszczeniu przygotowujemy PCR, rozcieńczamy matryce, puszczamy żele i utylizujemy materiał. Jest to najbardziej narażona na skażenie cześć laboratorium, idealny pokój tego typu jest całkowicie wyłożony kafelkami i powierzchniami zmywalnymi, odpornymi na silne utleniacze.  Zamiast komory laminarnej (radzę sobie ją całkowicie odpuścić o ile nie pracujemy z próbkami o wysokim zagrożeniu biologicznym lub z mikrośladami!) radzę  właśnie kafelki. Zero półek, zakamarków, tylko stół, krzesło, 1 zestaw pipet i nic poza tym. Wszystko powinno dać się odkazić po zakończonym dniu pracy! (czym odkażać? O tym będzie traktować druga część opracowania!)

3. Mit lampy UV

W laboratoriach medycznych i badawczych złotym standardem jest dekontaminacja przy użyciu światła UV. Jest to bardzo dobre rozwiązanie, ale dla mikrobiologów i osób pracujących z hodowlami in vitro.

*     UV absolutnie nie nadaje się za to do pozbywania się DNA z powierzchni roboczych, jest na to zbyt mało wydajne!  Światło UV ma moc biobójczą, i mutagenną, ale nie lityczną w stosunku do polimerów DNA. Poza tym jego działanie jest ograniczone do przestrzeni nieporowatych, wystawionych bezpośrednio na promieniowanie.

*     UV zażółca papier i niszczy niektóre tworzywa sztuczne, więc nie powinniśmy trzymać tam dokumentacji.

*     Jeszcze jedna ważna rzecz, o której się nie pamięta. Światło UVC  jest potężne, ale świetlówki szybko się zużywają. Po roku tracą nawet połowę swojej emisji UVC- taka świetlówka już nie nadaje się do dekontaminacji.

Komu więc polecać UV?

Pracowniom, które pracują z ludzkimi płynami ustrojowymi do pomieszczeń, w których wykonuje się np. ekstrakcję białek czy kwasów nukleinowych i gdzie utylizuje się materiał. Obowiązkowo do pracowni mikrobiologii i tam, gdzie prowadzi się hodowle komórkowe. UV nie radzi sobie z wirusami tak wydajnie jak z bakteriami, ale i tak pomaga w walce np. z fagami. Natomiast UV w pomieszczeniach do PCR i pod komorami laminarnymi sprawdza się raczej słabo. Można je stosować jako dodatkowy środek ochronny- wszak nie zaszkodzi, ale pożytku z niego niewiele.

W drugiej części opracowania dowiecie się, jakie chemiczne i fizyczne środki zaradcze można zastosować, by pozbyć się niechcianego DNA z powierzchni laboratoryjnych.

Usunięcie kontaminacji DNA
wcale nie jest sprawą prostą, przekonało się o tym wielu biologów molekularnych!

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    Jeżeli mówimy o dobrej praktyce laboratoryjnie to na pewno nie jest nią nakładanie tupsów do pudełek. Liczące się laboratorium stosuje tipsy fabrycznie pakowane w pudełka, dodatkowo z filtrem. Albo chce się pracować dobrze, albo tanio.

    2 lata temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry