Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 27 lutego 2016

Liczba komentarzy: 0
Wyniki fałszywie pozytywne w PCR! Jak się przed nimi bronić? (II)

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

„Kontaminacja” to chyba najbardziej przerażające wyrażenie w słowniku każdego biologa molekularnego. Przypadkowe przeniesienie produktu PCR na blaty, plastiki lub sprzęt laboratoryjny może zamienić życie pracowników laboratorium  w koszmar na długie tygodnie. Jak nie dopuścić do tej sytuacji? W części pierwszej przestawiłam podstawowe sposoby na uniknięcie fałszywych pozytywów i obnażyłam słabości lamp UV. Dziś przedstawiam Wam rozwiązania , które można zastosować, jeśli już kontaminacja nam się zdarzyła.

1. Na kłopoty… wybielacz

W pierwszej części tego dwuodcinkowego cyklu wspominałam, że pomieszczenie w którym pracować będziemy z produktami PCR powinno być odporne na utleniacze. Co konkretnie miałam na myśli? Żeby pozbyć się DNA najprościej jest je chemicznie unieszkodliwić. Są na to dziesiątki sposobów, a jak zwykle najlepsze są te najtańsze i znane z naszych gospodarstw domowych.

*     W literaturze spotykamy różne pomysły na dekontaminację, prym wiedzie HCl i  mieszaniny kwasu z rozmaitymi substancjami (np.glicyną) wspomagającymi. HCl 1M obniża pH do tego stopnia, że indukuje depurynację i hydrolizę DNA.  Gorący kwas solny z glicyną jest szczególnie polecany do dekontaminacji końcówek pipet, jednak mycie nim większych powierzchni jest kłopotliwe. Poza tym kwaśna hydroliza wymaga albo podwyższonej temperatury, albo długiego czasu ekspozycji. Dlatego nie jest polecana do ogólnych zastosowań.

*     DNA ulega hydrolizie także pod wpływem środków do sterylizacji i dezynfekcji wysokiego stopnia, takich jak tlenek etylenu i gazowy formaldehyd oraz aldehyd glutarowy. Jednakże tych związków każdy z nas chciałby unikać jak ognia- uwierzcie na słowo. Są to środki bardzo korozyjne i niebezpieczne dla błon śluzowych, używane w celu całkowitej eliminacji patogenów np. z materiałów i narzędzi chirurgicznych. Nie wiem, czy gdziekolwiek stosuje się rutynowo te środki (może poza formaldehydem, znam osobę która używa tej nad wyraz nieprzyjemnej substancji).

*     Dostępne w katalogach niektórych firm produkujących odczynniki są specjalne, przeznaczone do dekontaminacji preparaty typu „DNA-Away”. Mogą to być roztwory DNAz lub środki chemiczne. Są stosunkowo drogie, a ich skuteczność jest podobna jak rozwiązań opisanych poniżej.

*     Najlepsze w walce z kontaminacją DNA są … komercyjnie dostępne wybielacze i środki czyszczące.  Odpowiednio rozcieńczony roztwór NaOCl tworzy nacięcia nici (nick’uje DNA) i tym samym uniemożliwia amplifikację. Podobnie działa wiele innych środków dostępnych w sklepach z chemią gospodarczą. Tabletki calgonitu, zawierające wodorotlenki sodu i potasu oraz podchloryn, wszelkie środki w sprayu wydzielające wolny chlor lub tlen rodnikowy (oparte na eterach, epoksydach, aldehydach) są jak najbardziej skuteczne i bardziej bezpieczne dla użytkownika niż środki do sterylizacji gazowej.

* Jak używać wybielacza? Ważne jest stężenie aktywnego chloru. DNA-bójczo działa nawet 0,5% roztwór, wystarczy więc odpowiednio rozcieńczyć wybielacz i przemyć blaty. Albo zastosować spryskiwacz. Ważne jest, by pozostawić warstwę wybielacza na mytej powierzchni przez 15minut albo  do wyschnięcia, a potem zmyć wodą. Najlepsze działanie związków generujących rodniki tlenowe i wolny cholor otrzymujemy przy kontakcie preparatu z powietrzem, dlatego nanosimy cienką warstewkę. Dlatego nie urządzamy kąpieli np. statywów w wybielaczu, raczej je spryskujemy.

Tipsy z filtrem- koszt który warto ponosić

W połączeniu z regularnym myciem powierzchni wybielaczami i okresowymi kąpielami końcówek pipet w HCL-glicynie, dobrze jest stosować tipsy z filtrem jako prewencję w codziennej praktyce laboratoryjnej. Tipsy z odpowiednio umiejscowionymi, grubymi filtrami pozwalają na ochronę pojedynczych próbek przed aerozolami DNA, które mogą osadzić się na dispenserze podczas pipetowania. Taka ochrona jest szczególnie polecana w laboratoriach diagnostycznych i w placówkach korzystający z metod QPCR i nested PCR.

Warto zwrócić uwagę na jakość filtra. Spotkałam się z produktami, w których silikonowa wkładka nie powinna w ogóle zostać uznana za filtr, gdyż jej niewielka grubość nie zapewniała żadnej ochrony. Na rynku dostępne są końcówki zawierające nawet 2 lub 3 warstwy filtrujące- takiemu rozwiązaniu nie oprze się żaden aerozol DNA. Nie polecam oszczędzać na końcówkach z filtrem, jeżeli w naszym laboratorium zdarzały się w przeszłości zanieczyszczenia, oraz w sytuacji, gdy nie dysponujemy pomieszczeniami dedykowanymi do PCRu i komorami laminarnymi. Oszczędność 10zł na opakowaniu tipsów może nas kosztować setki złotych stracone na powtarzaniu reakcji PCR!

UNG: rozwiązanie wygodne, ale nie zawsze praktyczne

Uracylo-N-glikozylacja to elegancka metoda unieszkodliwiania kwasów nukleinowych po reakcji PCR. Używana jest już od wielu lat i pozwala na większą swobodę pracy z produktami PCR.

*     UNG to system amplifikacji opartej na deoksyurydynie zamiast deoksytymidynie. Po reakcji PCR otrzymujemy produkt z inkorporowanym dU, który (o ile zostanie przeniesiony do kolejnej reakcji) jest niszczony przez specjalny, dodawany do reakcji enzym urydylo-N-glikozylazę przed rozpoczęciem właściwej amplifikacji PCR. Tym sposobem nici zawierające dU degradują i nie mogą stanowić matrycy w tej reakcji.

*     Warto zasygnalizować, że UNG pozwala na uniknięcie kontaminacji tylko matrycami z inkorporowanym dU z poprzednich reakcji PCR< nie daje natomiast żadnej ochrony przed kontaminacją na pierwszych etapach pracy z analitem. Tak więc wracamy do punktu wyjścia, czyli opisanego w I części tego opracowania GLP.

*     Drugim ważnym mankamentem może być bezzasadność wykorzystania UNG w reakcjach nested-PCR, w których konieczne jest reamplifikowanie matrycy z poprzedniego PCRu. Można do drugiego MIXu nie dodawać UNG, ale w ten sposób znowu wystawiamy się na kontaminację!

Wybielacz
nie powinno go zabraknąć w łazience i w ... laboratorium!

Tak oto wspólnie dotarliśmy do końca opracowania, które może ułatwi Wam pracę w czystym, wolnym od kontaminacji otoczeniu. Czego Wam i sobie życzę!


Opracowanie powstało na bazie własnych doświadczeń, jednak niezwykle pomocne okazały się artykuły z BiteSizeBio:

Eliminate PCR Amplicon Carry-Over With UNG

PCR: The Right Way to Decontaminate and Eliminate False Positives

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry