Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 06 grudnia 2011

Liczba komentarzy: 2
Jeszcze głębsze sekwencjonowanie, czyli SMS po NGS

Wielu z nas jest już całkiem osłuchanych z technologiami „głębokiego sekwencjonowania” (ang. Next Generation Sequencing,, NGS). W Polsce na palcach jednej ręki można policzyć szczęśliwców, którzy mogą się pochwalić posiadaniem tej technologii, ale Chiny i USA w każdej sekundzie generują gigabajty danych genomowych z eksperymentów w które zaangażowane są  sekwenatory II generacji. Wydaje się, że technologia sekwencjonowania dopiero raczkuje. Czy jesteśmy jednak w stanie przewidzieć dokąd nas zaprowadzi? Pewne pomysły rodem z najdziwniejszych opowiadań science fiction już się ziściły. Bo kto by jeszcze niedawno temu pomyślał, że można będzie z powodzeniem odczytywać sygnał od pojedynczej cząsteczki polimerazy?

Przełom

Przez blisko 30 lat sekwencjonowanie oparte było na tak zwanej metodzie Sangera. W skrócie, pojedyncza, niewielka, homogenna matryca (plazmid lub produkt PCR) była amplifikowana podobnie jak w tradycyjnej reakcji PCR ale z dodatkiem specjalnie znakowanych dideoksynukleotydów, które kończył reakcję elongacji pojedynczej cząsteczki na pewnym etapie. Metoda ta, jak bardzo innowacyjna nie była, była ślepą uliczką ewolucji techniki sekwencjonowania.

Nowe technologie najpierw zostały wymyślone koncepcyjnie, by doczekać dopiero po kilku latach realizacji, gdy inżynieria materiałowa  poszła do przodu, dając teoretykom narzędzia do wprowadzenia idei w życie. Zasada we wszystkich systemach Next-Gen (454 Roche’a, Solexa Illuminy, SOLiD Aplery) jest taka sama, zobrazuję ją przy pomocy SOLiD, która wydaje się być najłatwiejsza do wyobrażenia:  DNA jest „kruszony” na krótkie fragmenty, w oparciu o które tworzona jest biblioteka poprzez dołączenie adaptorów.następnie DNA wprowadzane jest do specjalnej emulsji koloidowej. Okrągłe cząstki polimeru w otoczce z fazy wodnej (bufor),  są zawieszone we frakcji lipofilnej tworząc „mikrośrodowiska” dla pojedynczych reakcji amplifikacji. Każda cząstka polimeru jest opłaszczona oligonukleotydami, do których cumuje fragment DNA. Jest on amplifikowany w swojej mikrosferze, nici potomne znów przyłączają się do tej samej sfery ale w innym miejscu i tak postępuje amplifikacja. To, co się dzieje z takimi „włochatymi kulami” podczas odczytu sygnału, wygląda inaczej w przypadku każdego z systemów, dochodzi jednak każdorazowo do emisji fluorescencji, która jest rejestrowana osobno dla każdej z „kul”, dając w efekcie dziesiątki tysięcy pojedynczych odczytów, zapisywanych w pamięci superwydajnych komputerów w MB/sekundę czy nawet w GB/sekundę!

W przypadku innego podejścia, stosowanego np. w metodzie Solexa amplifikacja przebiega odmiennie, w fazie stałej a nie płynnej i przy użyciu innego sposobu cumowania bibliotek DNA. Po szczegóły odsyłam do bardzo dobrych opracowań na seqanswes.com: [1] i [2]

Idzie nowe

II generacja sekwencjonowania ma jednak znaczące ograniczenia. Ponieważ odczytywane są niewielkie fragmenty, nie ma możliwości sekwencjonowania repetytywnych fragmentów genomu, a więc np. mini i mikrosatelitów, sekwencji centromerowych i telomerowych itd. Po prostu montowanie w kontigi kawałków powtarzających się ciągów kilku nukleotydów jest niewykonalne. Receptą na ten mankament może być zastosowanie całkiem nowego podejścia, które przede wszystkim musi zostać opracowane w skali „nano”. Podejście takie nazwano „SMS”, czyli Single Molecule Sequencing.

W zasadzie niewiele zmienia się w samej idei (oprócz, rzecz jasna, skali!). Odpowiednia faza stacjonarna wiąże pojedyncze cząsteczki kwasu nukleinowego i odczytuje sygnały pojedynczych błysków świetlnych lub zmian elektrycznych generowanych przy dołączaniu przez polimerazę pojedynczych nukleotydów. Pierwszym z systemów SMS (aczkolwiek zarzuconym wg mojej wiedzy) był Helicos, kolejne dwa, PacBio i IonTorrent są wciąż dopracowywane i„mają przed sobą przyszłość. PacBio operuje na pojedynczych cząsteczkach immobilizowanej polimerazy i ma ogromny zakres odczytu, nawet 16tys nukleotydów w pojedynczej reakcji. Problemem jest natomiast niedoskonałość odczytu i niestabilność polimerazy poddanej bardzo dużym stresom energetyczny związanym ze wzbudzaniem fluorescencji światłem lasera. Za to IonTorrent zamiast fluorescencji odczytuje zmiany pH- każdy dołek fazy stacjonarnej to mini-pHmetr, który odnotowywuje lokalne zmiany pH powstające podczas emisji protonu z przyłączanego nukleotydu! Moim zdaniem to rozwiązanie oferuje największe możliwości i w przyszłości ma szansę zostać zdobywcą genomowej nagrody X.

Genomowa Nagroda X
Wielu pretendentów, wiele genialnych technologii...

 

Źródło:

Forum SeqAnswers.

 

Marzena Pieronkiewicz

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 2

  1. 1

    Z całym szacunkiem ale radziłbym zajżeć do publikacji i nie mylić pojęcia flow cell z beeds czy też amplifikacji w emusyjnym PCR a amplifikacji nazwijmy to „mostkowej”

    5 lat temu
  2. 2

    Cenna uwaga- użyłam flow cell w dość niefortunnym sformuowaniu.
    Natomiast w kwestii technik opartych o bridge/emultion PCR – idea obu jest bardzo zbliżona poza sposobem generowania produktu PCR. Chciałam raczej ogólnie zobrazować poszczególne etapy NGS na przykładzie SOLiDu nie wchodząc w szczegóły dotyczące samej amplifikacji. Mimo to dokonałam korekty tekstu wspominając o różnych podejściach do PCR.
    Dziękuję za konstruktywną krytyka.

  3. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry