Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 21 listopada 2011

Liczba komentarzy: 0
Oczyszczanie białek rekombinowanych kluczowym etapem ich produkcji

Z produkcją białek rekombinowanych w różnych systemach ekspresyjnych wiąże się wiele zagrożeń. Jednym z nich jest możliwość zanieczyszczenia produktu końcowego toksynami (w przypadku produkcji białek w bakteriach), wirusami czy innymi patogenami (w przypadku zwierzęcych systemów ekspresyjnych) lub metabolitami wtórnymi (w przypadku wykorzystania roślin transgenicznych). W jaki sposób wyeliminować wymienione zanieczyszczenia? Jak szybko i bezpiecznie wyodrębnić pożądane przez nas białko z mieszaniny ekstrakcyjnej?

Proces oczyszczania jest najdroższym i kluczowym etapem całego procesu produkcji białek rekombinowanych. W celu ułatwienia tego procesu i obniżenia jego kosztów często wykorzystuje się strategie, w których do rekombinownych białek dołącza się dodatkowe sekwencje nazywane etykietami powinowactwa (ang. affinity-tag). Wszystkie te systemy łączą w sobie następujące cechy: łatwy, jednoetapowy proces oczyszczania oparty na zjawisku adsorpcji, minimalny wpływ na strukturę trzeciorzędową oraz biologiczną aktywność produktu, prosty i specyficzny proces usunięcia etykiety, możliwość nieskomplikowanej oraz dokładnej analizy rekombinowanego białka w trakcie procesu oczyszczania oraz uniwersalność, czyli możliwość zastosowania w różnych białkach. Dodatkowo etykiety powinowactwa mogą być umieszczone w każdej pozycji (na N-końcu, wewnątrz sekwencji białka, na C-końcu) oraz mogą zostać użyte do detekcji oznakowanych w ten sposób białek, na przykład z użyciem odpowiednich przeciwciał.

Najczęściej wykorzystywanymi etykietami powinowactwa są: etykieta polihistydynowa (ang. poly-His), składająca się od 2 do 10 (najczęściej 6) powtórzeń histydyny, etykieta c-myc o sekwencji EQKLISEEDL, etykieta poliargininową (ang. poly-Arg) składająca się od 5 do 6 (najczęściej 5) powtórzeń argininy oraz wielu innych.

W niektórych przypadkach niezbędne jest usunięcie etykiety powinowactwa po procesie oczyszczania. Najczęściej wiąże się to ze sposobem późniejszego wykorzystywania produktu. Szczególnie w przypadku biofarmaceutyków proces ten jest koniecznością. Etykiety powinowactwa mogą być usuwane przy użyciu metody chemicznej z użyciem bromocyjanku lub hydroksyloaminy. Niestety sposób ten jest mało specyficzny i może prowadzić do denaturacji lub modyfikacji aminokwasów białka. Druga metoda, enzymatyczna, jest dużo bardziej dokładna. Używa się w niej specjalnych endoproteaz (np. enterokinazy, trombiny, czynnika Xa) lub egzopeptydazy (np. TAGZyme, aminopeptydaza M) rozpoznających specyficzne sekwencje odpowiadające sekwencjom etykiet i usuwające je.

Inną bardzo ciekawą strategią możliwą do zastosowania w przypadku roślin jest skierowanie rekombinowanego białka do ciałek tłuszczowych nasienia. Zjawisko to wykorzystano w przypadku hirudyny, antykoagulantu, po raz pierwszy wyizolowanego z pijawek Hirudo medicinalis. Fuzja heparyny z oleozyną spowodowała skierowanie produkowanego białka do ciałek tłuszczowych nasion rzepaku. Powstały produkt oczyszczano poprzez odwirowanie i flotację.

Ostatnio coraz częściej wykorzystuje się również fuzję białek z polipeptydem GVGVP (w różnych powtórzeniach), nazywanym również elastyną, która umożliwia ich jednoetapowe oczyszczanie z użyciem chromatografii. Dodatkowo białka te charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w wodzie poniżej temperatury przejścia fazowego, natomiast po jej podwyższeniu tworzą agregaty. Kolejnym sposobem na ułatwienie procesu oczyszczania jest fuzja białek z chaperonami, które działają stabilizująco oraz ochraniają białka rekombinowne przed działaniem proteaz komórkowych.

Katarzyna Kamel

Źródło:

Arnau J., Lauritzen C., Petersen G. E., Pedersen J., Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, „Protein Expression and Purification”, Vol. 48 (2006), s. 1-13

Daniell H., Streatfield S. J., Wycoff K., Medical molecular farming: production of antibodies,biopharmaceuticals and edible vaccines in plants, „TRENDS in Plant Science”, Vol. 6 (2001), s. 219-226

De Cosa B., Moar W, Lee S.-B., Miller M, Daniell H, Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals, „Nature Biotechnology” Vol. 19 (2001), s. 71-74

Terpe K., Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, „Applied Microbiology and Biotechnology”, Vol. 60 (2003), s. 523-533

Oczyszczanie białek rekombinowanych jest niezbędnym etapem ich produkcji
image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry