Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 21 lutego 2013

Liczba komentarzy: 0
Real Time PCR— sondy molekularne

W przeciwieństwie do barwników niespecyficznych (np. SYBR Green), sondy molekularne pozwalają na wysoce precyzyjną i czułą detekcję kwasów nukleinowych metodą PCR w czasie rzeczywistym. Najczęściej stosowane są oligonukleotydy (sondy TaqMan, Molecular Beacons), wykorzystujące zjawisko rezonansowego transferu energii pomiędzy dwoma fluoroforami (FRET).

W metodzie FRET (Förster Resonance Energy Transfer) fluorochrom pierwszy (zwany reporterem) w wyniku wzbudzenia falą świetlą o odpowiedniej długości, przenosi energię na fluorochrom drugi (wygaszacz), który następnie emituje kwant światła o innej długości lub powoduje wygaszenie emisji reportera.

Rodzaje sond

Pierwszymi i wciąż najbardziej popularnymi specyficznymi detektorami są sondy TaqMan — krótkie oligonukleotydy, wyznakowane dwoma fluorochromami: reporterem na 3’ końcu (np. FAM, NED) oraz wygaszaczem na końcu 5’ (najczęściej TAMRA). Odległość, pomiędzy tymi cząsteczkami jest niewielka, przez co nienaruszona sonda nie emituje fluorescencji (fluorofor 5’ końca powoduje całkowite wygaszenie emisji reportera). Dopiero podczas etapu wydłużania (po związaniu się sondy z sekwencja komplementarną) dochodzi do degradacji oligonukleotydu przez polimerazę Taq, co powoduje rozdzielenie fluoroforów i emisję światła o danej długości fali.

Dostępne są również modyfikacje sondy TaqMan — zamiast fluoroforu na 3’ może być użyty niefluorescencyjny wygaszacz, którym jest cząsteczka wiążąca mniejszą bruzdę w DNA (tzw. NFQ-MGB, nonfluorescent quencher-minor groove binder). Wygaszacz taki nie emituje światła, co w praktyce oznacza niższe tło oraz bardziej precyzyjny pomiar. Podwyższa on również temperaturę topnienia sondy bez konieczności jej wydłużania, co zwiększa specyficzność reakcji. Ponadto krótkie sondy znajdują wykorzystanie m.in. w genotypowaniu polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP, single nucleotide polymorphism).

Innym rodzajem sond molekularnych są oligonukleotydy typu Molecular Beacons. Sonda taka posiada komplementarne do siebie końce 3’ i 5’ (wyznakowane dwoma fluoroforami), przez co przy braku sekwencji wiążącej (targetu) tworzy strukturę pnia i pętli (czyli tzw. spinki do włosów) i nie emituje światła. Natomiast, gdy sonda ulega związaniu do regionu docelowego (pętla jest do niego komplementarna) dochodzi do zmiany konformacyjnej (linearyzacji sondy) i emisji fluorescencji przez cząsteczkę reportera. Wygaszaczem fluorescencji w sondach tego typu najczęściej jest cząsteczka nie będąca fluoroforem (np. DABCYL).

Producenci odczynników do real time PCR oferują nam także inne rozwiązania. Amplifluor Primers to połączenie sondy i startera w jednym oligonukleotydzie — koniec 3’ jest komplementarny do sekwencji docelowej, natomiast na 5’ końcu znajduje się fluorescencyjny znacznik. Scorpion Primers z kolei, to również połączenie sondy ze starterem, lecz w takim oligonukleotydzie kowalencyjnie przyłączona sonda wyznakowana jest dwoma fluoroforami. W obu powyższych przypadkach, emisja fluorescencji zachodzi po związaniu z DNA (lub RNA jeśli reakcją jest reverse transcription real time PCR).

Nieco innym rozwiązaniem jest stosowanie znaczników typu Plexor Primers — w tej metodzie wykorzystywane są dwa zmodyfikowane startery (posiadające reszty izoguanozyny oraz izocytozyny), których nietypowe nukleotydy mogą tworzyć wiązania wodorowe jedynie same ze sobą. Startery takie są również odpowiednio wyznakowane – jeden z nich (z nukleotydami izo-dC) zawiera na 5’ końcu fluorofor, natomiast drugi (posiadający nukleotydy izo-dG) połączony jest z niefluorescencyjnym wygaszaczem. Połączenie się obu starterów podczas reakcji powoduje wygaszenie wcześniej emitowanej fluorescencji.

Projektowanie specyficznych starterów

Podobnie, jak w przypadku detekcji niespecyficznej odpowiednie zaprojektowanie oligonukleotydów jest kluczowym etapem w wykorzystaniu techniki real time PCR. Warto pamiętać o kilku następujących zasadach:

* długość amplikonu (dla optymalnej amplifikacji) powinna wynosić od 50 do 150 pz;

* optymalna długość starterów to około 20 pz, a ich sekwencje nie mogą powielać się z sekwencją sondy;

* optymalna Tm starterów to 58 – 60°C;

* zawartość GC starterów oraz sondy powinna wynosić od 30-80%;

* koniec 3′ starterów nie może być bogaty w nukleotydy G lub C (nie więcej niż 5);

* długość sondy powinna wynosić od 13 do 25 pz;

* optymalna Tm sondy to 68 – 70°C;

* ostatnim nukleotydem od końca 5’ sondy nie może być G (reszta ta będzie wygaszać reporter nawet po odcięciu sondy przez polimerazę!)

* powtarzających się nukleotydów (w szczególności reszt G);

* następujących po sobie reszt A;

* dinukleotydów CC (szczególnie w środku sekwencji sondy, gdyż będzie to redukowało sygnał) .

Trudny wybór? Oto podsumowanie


AM

Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Reklama
Ankieta
Czego szukasz w Portalu?
do góry