Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 05 marca 2016

Liczba komentarzy: 2
Cytometria przepływowa w pigułce

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Technika cytometrii przepływowej  jest obecnie szeroko stosowana zarówno w badaniach podstawowych, jak i diagnostyce medycznej. Na czym polega ta metoda i jak posługiwać się nią w praktyce?

1. Zasada działania

Rozłóżmy termin „cytometria przepływowa” na czynniki pierwsze. Nazwa techniki oznacza „pomiary [metria] komórek [cyto] podczas ich przepływu [przepływowa]” . Takie tłumaczenie w zasadzie zastępuje definicję, chociaż oczywiście nie wyczerpuje tematu. Jak dokonywany jest pomiar parametrów komórek i jak osiągane jest to podczas przepływu cieczy? Istotą metody jest ułożenie komórek do pomiaru pojedynczo, w rządku, a następnie dokonanie ich pomiaru przez odpowiednio skierowane światło lasera – czasami cytometrię nazywa się także „cytofluorymetrią”, ponieważ część pomiarów opartych jest na detekcji fluorescencji.

https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio

2. Budowa cytometru

Cytometr przepływowy złożony jest z:

-komory, przez którą przepływają kolejno komórki,

-plątaniny rurek z buforem płuczącym, który wymusza laminarny przepływ

-lasera, którego wiązka światła rozprasza się na każdej z komórek i/lub wzbudza fluorescencję znaczników związanych z komórkami

-rejestratorów wiązki światła, które przetwarzają sygnał na cyfrowy

-układu optycznego, złożonego z zestawu filtrów i pryzmatów, które skupiają światło by umożliwić jego odczyt

-sprzężonego z aparaturą komputera, który dokonuje interpretacji i obróbki danych.

Centralną część cytometru przepływowego zajmuje komora, w której próbka, zawierająca heterogenną grupę komórek, jest poddana laminarnemu przepływowi roztworu płuczącego.  Liniowy przepływ jest niezbędny, by komórki pojedynczo trafiały w okienko pomiarowe, gdzie pada na nie światło lasera – każdy pomiar sygnału powinien dotyczyć pojedynczej komórki.

W jaki sposób komórki układają się po kolei w rządku niczym w komitecie kolejkowym? Taki efekt udało się otrzymać poprzez zastosowanie kilku strumieni roztworu NaCl o różnej prędkości, malejącej od zewnątrz do środka wiązki cieczy. Taki prąd laminarny wymusza na komórkach wejście w sam środek strumienia i rozcieńcza je odpowiednio.

Generatorem światła o odpowiednio wysokiej energii jest laser, którego precyzyjna wiązka pada na komórkę. Światło odbite i rozproszone przez błonę komórkową i organelle pada na detektory pod innym kątem, pozwalając na prosty pomiar wielkości i ziarnistości komórki. Bardziej złożony pomiar fluorescencji wymaga zastosowania zestawu blend i pryzmatów, które kierują światło o odpowiedniej energii fali na detektor.

Analizator sygnału przetwarza natężenie światła na odpowiedni sygnał cyfrowy, który jest interpretowany komputerowo.

2. Forward i Side Scatter

Jak odbywa się pomiar światła i w jaki sposób przekłada się on na oszacowanie wielkości i struktury komórek?

Otóż jeden z detektorów cytometru ustawiony jest na przeciwko wiązki światła padającej na komórkę, zbierając światło, które zostanie ugięte na brzegach komórki.  Intensywność i kąt padania tej wiązki na czytnik zależy od wielkości komórki- im jest ona większa, tym mocniej ugina światło (rycina 1).

Drugi z detektorów umieszczony jest prostopadle do wiązki światła padającej na komórkę. Część światła lasera załamuje się w różnych kierunkach  po przejściu przez gęste obszary komórki, takie jak ziarnistości i organelle komórkowe. Im bardziej skomplikowana struktura wewnętrzna komórki, tym silniej światło jest załamywane i więcej go trafia na detektor boczny.

Odczyt światła z detektora przedniego nazywany jest z angielska „forward scatter” (FSC), zaś odczyt z detektora bocznego „side scatter” (SSC). (rycina 1)

Rycina 1:  Odczyt sygnału fluorescencyjnego w komorze cytometru polega na detekcji ilości światła odbitego i załamanego przez detektory znajdujące się z boku oraz naprzeciw wiązki lasera. W przypadku dużej, ziarnistej komórki takiej jak neutrofil, znaczna ilość światła zostanie skierowana na oba detektory, co na wykresie scatterplot zostanie przestawione jako sygnał w górnej prawej ćwiartce.

3. Pomiar fluorescencji

Oprócz tych dwóch form odczytu cytometr potrafi przeprowadzić także odczyt fluorescencji. Próbka, która została wcześniej wyznakowana odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z barwnikami jest identyfikowana przez czytnik boczny z zastosowaniem filtrów, przepuszczających tylko fale świetlne odpowiedniej barwy. Światło lasera pada na komórkę, która na powierzchni zawiera dany antygen ze związanym przeciwciałem i fluorochromem. Fluorochrom jest wzbudzany przez energię lasera i dochodzi do emisji fluorescencji we wszystkich kierunkach. Część energii fali świetlnej przechodzi przez filtr do detektora bocznego i zostaje zinterpretowana jako emisja fluorescencji. (rycina 2)

Rycina 2: Pomiar fluorescencji w komorze cytometru. Grafika została stworzona przez firmę Coulter Corporation, Miami,  USA. Pobrano z http://www.biotech.univ.gda.pl/odl/modern/fcm.html

4. Opis subpopulacji komórkowych i immunofenotypowanie

Prawidłowe zastosowanie parametrów FSC, SSC i jednoczesne wykorzystanie kombinacji różnych barwniwków pozwala na wielowymiarową interpretację danych i kompleksowy opis subpopulacji komórek. Cytofluorymetria znalazła zastosowanie głównie w diagnostyce hematoonkologicznej jako uzupełnienie metod patomorfologicznych, jej zastosowań jest jednak o wiele więcej.

Spróbujmy prześledzić, w jaki sposób możemy wyodrębnić subpopulację cytotoksycznychi regulatorowych limfocytów T spośród komórek z próbki krwi.

1. Przygotowujemy próbkę, dokonując osmotycznej lizy erytrocytów.

2. Znakujemy próbkę odpowiednim zestawem znakowanych przeciwciał. Będą nam potrzebne przeciwciała pozwalające wyróżnić całą pulę dojrzałych limfocytów (anty-CD3) oraz przeciwciała nacelowane na antygeny limfocytów cytotoksycznych (anty-CD8) i pomocniczych (anty-CD4).

3. Rozpoczynamy analizę. Na wykresie scatterplot zaznaczamy tę część populacji komórek, która odpowiada limfocytom, czyli małe i ubogoziarniste komórki

4. Wśród zaznaczonych komórek musimy wytypować populację CD3-dodatnią. Na histogramie zaznaczamy tylko komórki o wysokiej intensywności sygnału CD3+

5. Następnie wykonujemy wykres 2D, na którym na jednej odkładamy fluorescencję barwnika dla CD4+, na drugiej dla barwnika CD8+. W próbce krwi osoby zdrowej powinniśmy otrzymać dwie wyraźne populacje – przeważająca większość komórek plasuje się w ćwiartce CD4+,CD8-, mniejszość w ćwiartce CD8+,CD4-.

6. U osób z chorobami autoimmunologicznymi, wrodzonymi zespołami niedoboru odporności, białaczkami i chłoniakami z linii T oraz zakażonych wirusem HIV stosunki ilościowe pomiędzy populacjami limfocytów mogą zostać zaburzone lub odwrócone.

Całą opisaną powyżej procedurę wraz z ilustracjami można prześledzić na stronie http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html

5. Sortowanie komórek

W ostatnich latach cytometria coraz bardziej zyskuje na znaczeniu ze względu nie tyle na samą umiejętność identyfikacji komórek, co na funkcję ich sortowania.  Potęga tego narzędzia jest obecnie wykorzystywana w wielu wysokospecjalistycznych procedurach medycznych – m.in. w allotransplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych, immunodeplecji (czyli usuwaniu) poszczegółnych linii komórkowych z materiału klinicznego czy też wzbogacaniu materiału do diagnostyki molekularnej w komórki wykazujące ekspresję  pewnych antygenów.

Co ciekawe, sortowanie komórek doskonale sprawdza się także w… hodowli zwierząt. W hodowli krów mlecznych nie jest potrzeba „produkcja” 50% byków.  Ze względu na różnice w intensywności  znakowania heterochromosomu X i Y stało się możliwe wzbogacanie spermy zwierząt w komórki żeńskie.

Sortowanie odbywa się w przystosowanych do tego cytometrach z przystawką sortującą (FACS, fluorescence activated cell sorting). Modyfikacja metody polega na rozbiciu w momencie odczytu sygnału wiązki laminarnego przepływu cieczy na małe kropelki, zawierające pojedyncze komórki. Kropelki są natychmiast obdarzane ładunkiem w zależności od tego, czy wykazują odpowiednią fluorescencję czy nie. Spadając, krople trafiają w pole eletrostatyczne i ich trajektoria jest uginana w zależności od posiadanego ładunku. W konsekwencji krople obdarzone różnym ładunkiem trafiają do zbiorników gromadzących poszczególne subpopulacje.

*Uwaga: w opracowaniu pominięto kwestię kompensacji sygnału fluorescencyjnego – w praktyce przed analizą fluorescencji należy przeprowadzić wyrównywanie różnic w emisji światła i korekcję tła różnych barwników przed wykonaniem analizy. Zainteresowanym polecam doskonałe opracowanie dotyczące tematu kompensacji.

 

 

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 2

  1. 1

    Proponowałbym zamienić termin immunofenotypizacji na immunofenotypowania, oraz proszę o sprostowanie dotyczące przeciwciał anty-CD4 – nie służą one do wykrywania limfocytów T regulatorowych, a limfocytów T pomocniczych. (limfocyty T regulatorowe stanowić mogą jedynie subpopulacje limfocytów T CD3+CD4+
    pozdrawiam

    4 lata temu
  2. 2

    Pardon, już ustosunkowuję się do cennych uwag!

  3. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry