Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 26 listopada 2016

Liczba komentarzy: 0
PCR bez izolacji – testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific

Specjalnie dla Was przetestowaliśmy w naszym laboratorium odczynniki firmy Thermo Scientific umożliwiające przeprowadzanie reakcji PCR z pominięciem etapu izolacji DNA.

Kity te, których dystrybutorem jest firma ABO, zawierają wysokiej jakości polimerazę typu HotStart odporną na wiele inhibitorów zawartych w tkankach oraz z domenę wiążącą się z DNA, wzmacniającą jej wydajność. Zestawy zawierają także Dilution Buffer oraz odczynnik DNARelease Additive pozwalające na łatwiejsze uwolnienie DNA z wielu różnych tkanek. Testowalismy 3 typy kitów:

1)      Phire ® Animal Tissue Direct Kit przeznaczony głównie do reakcji z użyciem tkanek zwierzęcych takich jak: uszy i ogony mysie, rybie płetwy, tkanki Drosophila, itp. – pełna lista na www.thermoscientific.com/directpcr;

2)      Phusion ® Human Specimen Direct Kit przeznaczony do reakcji z użyciem preparatów pochodzenia ludzkiego: wymazów z policzka, próbek śliny, paznokci, zębów, włosów, próbek skóry, a także preparatów utrwalonych w parafinie;

3)      Phusion ® Blood Direct Kit dedykowany głównie do reakcji z pełnej krwi obwodowej zarówno świeżej jak i mrożonej pobranej na wiele różnych antykoagulanów.

Do reakcji PCR, używa się  tkanki, której fragment dodaje się bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej zawierającej bufor, startery oraz polimerazę. Ciekawym rozwiązaniem jest dołączone do zestawów urządzenie „Harris Uni-Core” podobne do ołówka automatycznego, które pozwala na pobranie niewielkich porcji tkanek i przełożenie ich bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej.

Reakcje z użyciem 3 powyższych testów prowadzono zgodnie z protokołami producenta. Zaskakujące są krótkie czasy denaturacji (1-5sek), jak również pominięcie temperatury przyłączania starterów (!). Testowe reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50μl zgodnie z rekomendacjami producenta, podobnie skład mieszaniny PCR-mix również prowadzono ściśle wg zaleceń producenta.

Reakcje prowadzono z zastosowaniem starterów dostarczonych w zestawach w celu zminimalizowania ryzyka niepowodzenia reakcji. Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym i wizualizowano w świetle UV.

Po użyciu testu dedykowanego do tkanek zwierzęcych  – test nr 1 – próbki zawierały kolejno: fragmenty preparatów parafinowych (A i B) zawieszonych w niewielkiej kropli wody, próbki tych samych preparatów zawieszone w Dilution Buffer, dwie różne próbki z krwi obwodowej (zamrożonej),  leukocyty z tych samych próbek krwi zawieszone w Dilution Buffer. W przypadku tego testu porównano jakość rozdziału elektroforetycznego po zastosowaniu buforu obciążającego zawartego w zestawie dostarczonym przez producenta oraz buforu dotychczas stosowanego w laboratorium. Wyniki na rycinie:

W 6/8 próbek uzyskano prążki, nie uzyskano prążków w próbkach 2 i 4 pochodzących z tej samej tkanki, w takich przypadkach producent zaleca modyfikację warunków reakcji poprzez dodanie np. jonów Mg lub profilu termicznego (optymalizacja czasu denaturacji lub wydłużenie czasu elongacji). Po zastosowaniu buforu obciążającego stosowanego w laboratorium i buforu zawartego w zestawie Thermo Scientific Phire ® Animal Tissue Direct Kit nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy jakością i intensywnością prążków na żelu.

W drugiej kolejności testowano zestaw nr 2 dedykowany do preparatów  parafinowych. Do  PCR pobrano 4 fragmenty różnych preparatów, jednak w wyniku reakcji w żadnej próbce amplifikacja nie przebiegła właściwie – nie uzyskano prążków, po powtórnym przeprowadzeniu testu niestety nic się nie zmieniło.:

Analizując przyczynę niepowodzenia, wydaje się nam prawdopodobne, że kit Thermo nie jest dedykowany do bloczków parafinowych gorszej jakości, które nadal są w Polsce bardzo powszechne. Bardzo złej jakości polska parafina oraz sposób przeprowadzania materiału mogą uniemożliwiać wykonanie z sukcesem reakcji PCR  przy użyciu kitu Thermo Scientific. Dlatego najprawdopodobniej ten zestaw do reakcji PCR ze skrawków parafinowych w polskich realiach nie będzie się sprawdzał.

Jako 3. testowano odczynniki przeznaczone do reakcji bezpośrednio z krwi obwodowej. Producent zaleca dodanie nawet do 10µl krwi, w naszych testach użyto tych samych próbek co w kicie nr 1 (C, D), jednak do analiz pobierano kolejno po 1 µl, 5 µl i 10 µl.  Po reakcji przeprowadzonej zgodnie z zalecanym protokołem uzyskano oczekiwane produkty we wszystkich probówkach:

Prążki nr 3 i 6 wydają się słabsze, natomiast wynika to z mniejszej objętości próbek pobieranych do elektroforezy – po reakcji pozostała duża ilość resztek komórek na dnie probówki.

***

Podsumowując – testowane odczynniki spełniają nasze oczekiwania (w przypadku kitu nr 2, wydaje nam się, że że po pewnych modyfikacjach składu mieszaniny reakcyjnej udałoby się uzyskać produkt reakcji).

Ogromną zaletą odczynników typu „direct”  jest oszczędność czasu: przygotowanie reakcji, PCR i elektroforeza  zajmują niespełna 2 godziny!

Uzyskane produkty znajdują się na właściwej wysokości. Miłą niespodzianka jest też cena odczynników: w przypadku Phire® Animal Tissue Direct PCR Kit cena wynosi ok 1500 zł brutto za 200 reakcji, co w przeliczeniu daje ok. 7,5 zł za jedną reakcję. W przypadku zakupu  Phusion® Blood Direct PCR Kit na 500 reakcji, cena brutto za cały zestaw wynosi ok 2000 PLN – czyli tylko 4 zł za próbkę!

Biorąc pod uwagę, że pomijamy całą procedurę związaną z izolacją materiału genetycznego i oszczędzamy nasz cenny czas, cena wydaje się być bardzo atrakcyjna. Tym bardziej, że oferowane zestawy spełniają nasze oczekiwania.

dr n. med. Magdalena Zawada

diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki laboratoryjnej

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry