Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 29 marca 2016

Liczba komentarzy: 0
Sekwencjonowanie nowej generacji w diagnostyce medycznej

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing, NGS) szturmem wkroczyło w dziedzinę nauk biomedycznych. Obecnie jakiekolwiek badania podstawowe, dotyczące genetyki i biologii molekularnej trudno opublikować, jeśli nie wykorzystano w nich analiz NGS. Powoli pojawiają się także możliwości wykorzystania tej technologii w rutynowej diagnostyce klinicznej. Gdzie znalazła już ona, albo ma szansę znaleźć w najbliższym czasie, zastosowanie? Jakie są ograniczenia jej stosowania praktyce klinicznej?

Ograniczenia i szanse NGS w diagnostyce klinicznej

Stosowanymi obecnie narzędziami w rutynowej laboratoryjnej genetyce medycznej są cytogenetyka (klasyczna i FISH) oraz cały wachlarz metod biologii molekularnej, bazujący na amplifikacji pojedynczych fragmentów DNA*. Cały ten warsztat badawczy pozwala albo na mało szczegółową analizę rearanżacji chromosomowych albo szczegółową analizę pojedynczych mutacji/rearanżacji genowych w skali średnio kilkuset par zasad. Większość chorób genetycznych może być spowodowana przez szereg mutacji punktowych, czynnikiem sprawczym niektórych są aberracje chromosomowe na tyle małe, że nie udaje się wykryć ich techniką klasyczną. W onkologii mutacje chorobotwórcze lub predysponujące do zachorowania są rozproszone w wielu różnych obszarach genomu. W mikrobiologii metody molekularne rzadko stosowane są w celach przesiewowych zwykle są jedynie narzędziem pomocniczym z uwagi na możliwość wykrycia niewielu patogenów w pojedynczej reakcji. To tylko niektóre wady testów cytogenetycznych i molekularnych, które nie pozwalają na tak szerokie ich zastosowanie, jakbyśmy sobie tego życzyli. Przezwyciężyć wiele z tych kwestii technicznych może technologia głębokiego sekwencjonowania, która w zależności od zastosowania może zamienić się w wysokorozdzielcze narzędzie analizy cytogenetycznej, technikę molekularną wykrywającą kilkaset lub kilka tysięcy mutacji naraz, czuły test przesiewowy na obecność konkretnych typów drobnoustrojów, czy też potężny panel badań, wykrywający jednocześnie wiele spośród onkogenów złego rokowania [1,2].

Problem z technologią głębokiego sekwencjonowania polega z jednej strony na konieczności zastosowania zupełnie nowego i kosztownego zaplecza aparaturowego (sekwenatory i ich urządzenia peryferyjne, niezwykle wydajny sprzęt komputerowy, software i ogromna pamięć dyskowa) a z drugiej strony wymaga zatrudnienia zupełnie nowego typu fachowców, wyszkolonych bioinformatyków, zajmujących się niełatwą analizą terabajtów danych. Zastosowanie NGS do diagnostyki in vitro musi także spełniać określone normy jakości, gwarantujące określone wartości graniczne parametrów analitycznych [1,2]. Według danych amerykańskich, pod koniec roku 2013 jedynie ok. 50 laboratoriów w całych Stanach Zjednoczonych posiadało możliwość wykonywania testów (certyfikowanych przez FDA) techniką NGS. Obecnie może to już być kilkaset placówek [3].

Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie.
Źródło Wikimedia Commons, Autor Bainscou. Licencja CC BY 3.0

Przyszłość jest teraz

Na chwilę obecną są już dostępne testy diagnostyczne NGS z certyfikatem IVD i ich ilość stale rośnie. Illumina na przykład wypuściła gotowe testy przeznaczone na platformę MiSeq Dx, przeznaczone do diagnostyki mutacji warunkujących mukowiscydozę i wrodzone choroby serca. Chińska firma BGI specjalizuje się w produkcji testów przeznaczonych dla diagnostyki związanej z prokreacją – posiada w ofercie testy screeningowe na najczęstsze choroby genetyczne dla przyszłych rodziców czy też testy przesiewowe dla noworodków i niemowląt. Ich flagowym produktem jest zaś test Nifty do nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej, który można wykonać także w Polsce. Podobny test, Harmony, oferuje firma Ariosa Diagnostics.

Kolejną ważną gałęzią diagnostyki, dla której dostępne są certyfikowane testy NGS, jest oczywiście onkologia. Propozycje Thermo Scientific pozwalają na przykład analizować mutacje w guzach litych, oraz ekspresję kilku newralgicznych onkogenów. Singapurska firma Vela wypuściła testy Sentosa SQ, które umożliwiają detekcję mutacji w komórkach czerniaka złośliwego, raka tarczycy, jelita grubego, raka płuca i białaczek. Inny test dla hematoonkologii, dedykowany dla diagnostyki chłoniaków, posiada w ofercie firma Invivoscribe. Służy on do wykrywania klonalności rearanżacji TCR i IGH. BGI w swojej ofercie posiada natomiast test przesiewowy do detekcji wariantów 21 genów predysponujących do zachorowania na raka jajników i sutka (w tym BRCA1 i 2).

I co dalej?

Podane przykłady nie wyczerpują długiej listy dostępnych obecnie zestawów diagnostycznych, a ich lista z dnia na dzień rośnie. NGS zyskuje uznanie szczególnie w badaniach mikrobiologicznych (genotypowanie wirusów, m.in. HIV, analizach epidemiologicznych i diagnostyce drobnoustrojów z płynów ustrojowych pacjenta) oraz w badaniach rearanżacji chromosomowych, które były dotychczas domeną cytogenetyków. Na etapie walidacji są testy skriningowe dla wielu jednogenowych chorób rzadkich, związanych zarówno z genomem jądrowym, jak i mitochondrialnym. Na chwilę obecną poważnym ograniczeniem technologii jest stopień skomplikowania analizy bioinformatycznej i wymóg otrzymania odpowiedniej gwarantowanej ilości odczytów dla analizowanych amplikonów, co powoduje, że firmy produkujące zestawy diagnostyczne nie wykorzystują całkowicie potencjału tego narzędzia (np. ograniczając się do panelu kilkudziesięciu wariantów genowych, zamiast umożliwić wykrywanie kilkuset lub kilku tysięcy mutacji) [4].

Prawdopodobnie nie ma takiego badania genetycznego, w którym nie znajdzie zastosowania głębokie sekwencjonowanie. Pytanie brzmi nie „czy”, ale „kiedy” technologia ta upowszechni się w każdej dziedzinie genetyki medycznej.

* Bardzo rzadko korzysta się z metod porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) ze względu na wysoki koszt oraz MLPA, za sprawą jej niszowości. Pozwalają one na przezwyciężenie niektórych trudności, o których mowa w tekście

Piśmiennictwo:

1. Pant S. et al. Navigating the Rapids: The Development of Regulated Next-Generation Sequencing-Based Clinical Trial Assays and Companion Diagnostics. Front Oncol, 2014; 4: 78.

2. Meldrum C.et al.  Next-Generation Sequencing for Cancer Diagnostics: a Practical Perspective Clin Biochem Rev. 2011; 32, 4: 177–195.

3. Hughes MD. Molecular Diagnostics Market Trends and Outlook. IVD MarketReach, 2013.

4. Rizzo JM., Buck MJ. Key Principles and Clinical Applications of “Next-Generation” DNA Sequencing. Cancer Prevention Research, 2012.

 

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry