Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 13 lutego 2013

Liczba komentarzy: 1
Labowe „know-how” — rozdział białek SDS-PAGE (Schagger & von Jagow)

Przedstawiamy sprawdzony przepis na elektroforezę białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących w obecności SDS (SDS-PAGE) w systemie Schagger & von Jagow.

Używane bufory

  • Bufor katodowy 5x (na 1 L):
    • 61 g Tris                             0,5 M
    • 89,5 g tricyna                  0,5 M
    • 5,0 g SDS                            0,5%

nie korygować pH

 

  • Bufor anodowy 5x (na 1 L):
    • 121,1 g Tris-HCl             1 M

pH 8.9

doprowadź do  odpowiedniego pH stosując 10 M HCl

 

Roztwory do polimeryzacji żelu poliakrylamidowego

  • Bufor do żelu (na 100 ml):
    • 36,35 g Tris base            3 M
    • 0,3 g SDS                            0,3%

pH 8.45

 

  • Akrylamid/bis do białek, 5-100 kDa (na 100 ml):
    • 49,5% T, 3% C
  • 48 g akrylamidu
  • 1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu

 

  • Akrylamid/bis do peptydów (na 50 ml):
    • 49,5% T, 6% C
  • 23,25 g akrylamidu
  • 1,5 g N,N’-metylenobisakrylamidu

Uwaga! Roztwory akrylamidu przefiltruj przed użyciem i przechowuj w lodówce w ciemnej butelce.

  • Bufor do próbek (1:2):
    • 2,0 ml 0,5 M Tris pH 6.8
    • 1,6 ml glicerolu
    • 3,2 ml 10% SDS
    • 1,2 ml dH2O
    • na oko CBB G-250 lub bromofenol blue

+ 37,4 ul na 0,5 ml buforu b-merkaptoetanolu

lub + 50 mg/ml DTT

 

Bufor rozporcjuj i przechowuj w -20 st.

 

  • 10% APS
    • 1 g nadsiarczanu amonu rozpuść w 9 ml dH2O

Rozporcjuj i przechowuj w -20 st.

Po rozmrożeniu resztę wyrzuć!

 

Skład żeli poliakrylamidowych (na 2 lub 4 żele)

Składniki 

(dodawaj w tej kolejności!)

 

 

Żel rozdzielający (10%)

 

Żel zagęszczający (4%)

dH2O 4,86 ml 9,72 ml 8,325 ml 16,65 ml
Bufor do żelu 5,00 ml 10,0 ml 3,1 ml 6,2 ml
Akrylamid/bis 3,05 ml 6,1 ml 1 ml 2 ml
Glicerol bezw. 2,00 ml 4,00 ml
TEMED 7,5 µl 15 µl 7,5 µl 15 µl
APS 75 µl 150 µl 75 µl 150 µl
obj. końcowa 15 ml 30 ml 12,5 ml 25 ml

 

Uwagi:

— przy pracy z akrylamidem zawsze używaj rękawiczek (nitrylowych)!

— roztwór TEMED ma bardzo nieprzyjemny zapach — dodawaj go pod dygestorium

— jeśli chcesz, by żel szybciej spolimeryzował wstaw go do ciepłego pomieszczenia (37 st.) lub oświetl go mocno.

— upewnij się, że bufor katodowy nie wypływa – w przeciwnym wypadku rozdział się zatrzyma

— jeśli chcesz osiągnąć bardzo dokładny rozdział białek, prowadź elektroforezę przy niskim napięciu (40 V przez żel zagęszczający i 60 V przez żel rozdzielający)

SDS-PAGE — wybarwiony żel

AM

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    O ile nie używa się fotokatalizatora, to silne oświetlanie samo w sobie nie przyspiesza polimeryzacji żelu. Jest to błędne mniemanie wynikające z tego, że silne lampy po prostu wytwarzają dużo ciepła.

    3 lata temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry