Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 26 kwietnia 2013

Liczba komentarzy: 0
Odwrotna transkrypcja in vitro, czyli reakcja łamiąca centralny dogmat biochemii

Główny dogmat biochemii komórki opiera się na założeniu, że informacja genetyczna przekazywana jest w kierunku: DNA -> RNA -> białko. Całe szczęście nawet natura lubi czasem łamać schematy i pozwalać na niekonwencjonalne procesy. Takim przykładem jest odwrotna transkrypcja, czyli „przepisanie” informacji w kierunku odwrotnym, z RNA na DNA.

Mechanizm ten zachodzi w naturze (np. w cyklu życiowym wirusa HIV, czy w wydłużaniu telomerów) i został odkryty w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku przez onkologa Howarda Martina Temina (http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1975/temin-autobio.html). W laboratorium natomiast wykorzystywane są enzymy rekombinowane, ulepszone pod względem działania (szybsze i bardziej stabilne), będące najczęściej pochodnymi rewertazy wirusów białaczkowych, takich jak: mysi (Murine Leukemia Virus, MuLV, MLV) lub ptasi (Avian Myeloblastsis Virus, AMV), jak również ludzkiego wirusa HIV.

In vitro reakcja łańcuchowej reakcji polimeryzacji polegająca na odwrotnej transkrypcji (Reverse Transcription PCR, RT-PCR), potocznie zwana „odwrotką” to również synteza DNA na matrycy RNA. Odbywa się ona za pomocą odwrotnej transkryptazy (zwanej także rewertazą) — enzymu, który syntetyzuje nić DNA zgodnie z zasadą komplementarności nukleotydów, wraz z wbudowywaniem tymidylanu (dTTP), zamiast obecnego w RNA urydylanu (UTP). Powstały w reakcji komplementarny DNA  (ang. complementary DNA, cDNA) może być dalej namnażany za pomocą zwykłej reakcji PCR.

RNA do reakcji RT-PCR musi być wolny od zanieczyszczeń, dlatego też warto zwrócić uwagę na metodę uzyskiwania i oczyszczania tego kwasu nukleinowego. Obecnie na rynku istnieje wiele dostępnych zestawów umożliwiających wydajną  izolację RNA z takich materiałów, jak krew, tkanki stałe, płyny ustrojowe czy nadsącz komórkowy (w przypadku analizy replikacji RNA-wirusów). Większość z nich opiera się na zmodyfikowanej metodzie Chomczyńskiego, w której RNA wiązany jest do złoży krzemionkowych w obecności soli chaotropowych, a do elucji stosuje się wodę wolną od RNaz (np. wodę traktowaną DEPC). Do izolacji RNA komórkowego (np. przy analizie mRNA, a więc ekspresji genów) stosuje się także Trizol. Niezależne jednak od rodzaju metody użytej przy izolacji, warto sprawdzić ilość otrzymanego RNA, np. poprzez pomiar absorbancji prz 260 nm lub elektroforezę żelową.

Do reakcji RT-PCR potrzebny jest zestaw odczynników, do których oprócz odwrotnej transkryptazy należą: bufor z odpowiednimi jonami, mieszanina heksamerów lub oligo(dT), mieszanina deoksynukleotydów (dNTPs) oraz ultra czysta woda (wolna od RNaz). Heksamery to nic innego, jak 6-cio nukleotydowe odcinki jednoniciowego DNA o każdej możliwej sekwencji (46 możliwych kombinacji, a więc 4096 różnych oligomerów), które możemy wykorzystać do „przepisania” całej puli RNA obecnego w komórce (a więc rRNA, tRNA oraz mRNA). Natomiast mieszanina oligo(dT) zawiera oligomery tymidylanu, przez co jest wykorzystywana do wybiórczego „przepisania” jedynie mRNA — posiadającego na jedynym z końców powtórzenia deoksyadenylanu, czyli tak zwany ogonek poli (A). W obu przypadkach jednak warto zwrócić uwagę na obecność w zestawie inhibitora RNaz, dzięki czemu matrycowe RNA będzie chronione przez tymi enzymami (szczególnie, gdy reakcję przygotowujemy na powietrzu, a nie w komorach z laminarnym przepływem powietrza i filtrami HEPA).

Reakcja odwrotnej transkrypcji in vitro trwa w zależności od rodzaju enzymu od 1-3 godzin. Dla rekombinanowej rewertazy MuLV reakcja trwa ponad 2 godziny (10 minut w 25°C, 120 minut reakcji właściwej w 37°C oraz 5 minut w 85°C, podczas których enzym jest inaktywowany). Warto pamiętać o tym, że RNA często tworzy struktury drugorzędowe (na przykład o charakterze tak zwanej spinki do włosów), które nie zostaną rozdzielone przez odwrotną transkryptazę (gdyż nie posiada ona właściwości helikazy), dlatego też przed rozpoczęciem rekcji warto wykonać denaturację próbki zawierającej RNA (5 minut w 70°C). Po tym czasie oraz schłodzeniu próbki (na lodzie) można dodać mieszaniny reakcyjnej i wykonać reakcję.

Powstałe w reakcji cDNA jest bardziej stabilne niż RNA, lecz zdecydowanie mniej niż dwuniciowe DNA (na przykład plazmidowe), dlatego też zaleca się jego przechowywanie w -20°C (trwałość około kilku miesięcy). Otrzymane cDNA może być dalej wykorzystane w reakcjach PCR, czy PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR) na przykład do analizy ekspresji genów, czy produkcji danego typu RNA.

AM

Główny dogmat biochemii stanowi o przekazywaniu informacji genetycznej z DNA, poprzez RNA na białko. W naturze zachodzi jednak także reakcja odwrotna
image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry