Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 18 lutego 2016

Liczba komentarzy: 0
Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Manipulowanie stężeniami i programem termocyklera

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać?

Dziś zwiększamy tempo, starając się już nie tylko otrzymać produkt, ale dopracować amplifikację do perfekcji poprzez różne zabiegi chemiczne i fizyczne.

Manipulowanie stężeniami i programem termocyklera

W poprzednich częściach pisaliśmy o podstawach. O tym, jak otrzymać produkt. Jednakże kinetyka reakcji jest często równie ważna jak sam efekt w postaci obecności prążka na żelu. Co jeszcze możemy zrobić, by poprawić wydajność amplifikacji?

A. Zmieniamy stężenia starterów – jeżeli na żelu po PCR widzimy na wysokości poniżej 25-5o pz prążek, świadczy to o zbyt dużej ilości starterów dodanych do  PCR lub o słabej amplifikacji i tworzeniu par primer-dimer (czyli startery się „kleją” same do siebie i amplifikują się zamiast matrycy!). Pary primer-dimer możemy wyrugować podwyższając temperaturę annealingu, zaś słabą amplifikację powinniśmy poprawić albo przez zmianę stężeń MgCl2, albo inne modyfikacje omówione w częściach I-II.

Jeżeli nie widzimy w ogóle starterów na żelu, możemy zaryzykować podwyższenie ich stężenia, uważając by nie przesadzić. Może to pomóc zwiększyć plon amplifikacji lub nie, warto jednak spróbować (byle nie doprowadzić do przeładowania starterami, widocznego na żelu).

Co jeszcze możemy zrobić ze starterami? Może się okazać że różnią się one długością lub temperaturą annealingu,wtedy możemy zrównoważyć te różnice, zwiększając stężenie tego z nich, który jest krótszy i ma niższą temperaturę topnienia. Jest to stosowane najczęściej w reakcjach multiplex, w których poszczególne pary starterów wchodzą ze sobą w interakcje i często może być potrzebna taka ingerencja.

B. Zwiększamy ilość dNTP – raczej rzadko stosowany zabieg, może pomóc poprzez zmianę siły jonowej roztworu. Nie należy dodawać więcej niż 2-krotnie większej dawki dNTP niż zalecana przez producenta. bo to już w niczym nie może pomóc.

C. Zatężanie buforu reakcyjnego – metoda wykorzystywana czasami dla amplifikacji w multiplexie. Wiele polimeraz toleruje zwiększenie stężenia buforu reakcyjnego od 1,1x do nawet 2x. Wyższa siła jonowa rzekomo pomaga w amplifikacji na krótkich primerach i w reakcjach multiplex. Przy użyciu mojego zestawu do PCR nie widziałam różnic w amplifikacji wielu różnych matryc po zatężeniu buforu, ale wg autorów licznych publikacji (m.in. tej z Biotechniques) to może zadziałać.

D. Ilość matrycy – zwykle rozsądną minimalną ilością DNA dodawaną do reakcji PCR jest 10ng. Poniżej tej ilości da się wciąż otrzymać wyraźny produkt, jednak podczas wstępnego dopracowywania warunków lepiej mieć pewność, że zbyt mała ilość matrycy nie zakłóca przebiegu reakcji. Oczywiście matryca powinna być wolna od zanieczyszczeń organicznych i soli, najlepiej sprawdzona uprzednio w innej reakcji PCR i/lub oceniona spektrofotometrycznie pod kątem czystości i stężenia.

"Stutter"
po polsku nazywany bywa "czkawką" lub "jąkaniem się" polimerazy
Co do cDNA nie ma tak precyzyjnych wytycznych, amplifikacja zależy w bardzo dużym stopniu od rodzaju amplifikowanej matrycy RNA- czy jest to gen wysokokopijny, czy też niskokopijny? Czy amplifikujemy koniec 3′ czy też 5′ transkryptu?  Czy odwrotna transkrypcja była wykonana na oligo-dT, na heksamerach,czy też na starterze specyficznym? Jakiego zestawu użyliśmy do RT? Czasami brak produktu RT-PCR może świadczyć nie o braku amplifikacji, ale o bardzo niskiej ekspresji amplifikowanego genu w danej próbce, albo też o degradacji/zanieczyszczeniu matrycy. Jeśli chodzi o ilość cDNA poddawaną amplifikacji, to starajmy się korzystać (w przeliczeniu na RNA użyte do reakcji RT) z co najmniej 50ng RNA (dla przykładu może to być 1µl cDNA, jeżeli do 20µl reakcji RT dodane było 1000ng RNA, bo 1000/20=50).

Jeżeli nie jesteśmy pewni, czy w naszej próbce znajduje się mało czy dużo kopii amplifikowanego cDNA, możemy w niektórych przypadkach bardziej znanych organizmów posiłkować się profilami ekspresji genów, dostępnymi np.w bazie GEO lub TiGER.

Warto pamiętać jeszcze o jednym szczególe: wiele genów posiada kilka izoform tego samego genu ( alternatywny splicing!). Dlatego przed wyrzuceniem starterów podejrzanych o niespecyficzna amplifikację sprawdźcie, czy dodatkowe produkty to nie warianty splicingowe!

E. Program amplifikacji: czas i temperatura (szczególnie annealingu) mają znaczenie dla wydajności amplifikacji. Niestety tak jak w przypadku składników mieszaniny reakcyjnej, dla każdej matrycy idealne warunki amplifikacji trzeba wyznaczyć empirycznie. Generalnie programy PCR dzielimy na 2- i 3-etapowe. Dwuetapowe używane są zwykle w reakcjach qRT-PCR, ale nic nie stoi na przeszkodzie, by stosować je także w konwencjonalnym PCR. Wówczas naprzemiennie stosuje się temperaturę annealingu (zwykle ok. 60 stopni) i denaturację (94-95 stopni). Programy trójstopniowe pomiędzy annealingiem a denaturacją zawierają etap elongacji w optimum termicznym enzymu, ok. 72 stopni.

Warto wspomnieć także o drugim kluczowym dla reakcji PCR elemencie: o denaturacji wstępnej, która w przypadku enzymów rekombinowanych typu HotStart jest niezbędna dla aktywacji polimerazy. Ten etap może być zasadniczo pominięty dla enzymów nierekombinowanych (stosuje się zwykle tylko krótką, np. 2-minutową denaturację w 94 stopniach). Dla enzymów HotStart programujemy cykler na dłuższą denaturację wstępną zgodnie z instrukcją producenta, zwykle na 5-15 minut w temperaturze 95 stopni.

Oczywiście manipulowanie temperaturą nie wyczerpuje możliwości modyfikowania przebiegu reakcji. Możemy np. próbować wydłużać czas annaelingu i/lub elongacji. Bardzo skrajnym przykładem takiego postępowania jest tzw. rapid PCR. Ten wariant PCR polega na zerosekundowych (sic!), naprzemiennych etapach denaturacji (95-98 stopni) i annealingu (50-65 stopni)  w namnażaniu krótkich (<100pz) amplikonów. W rezultacie cała reakcja PCR może trwać zaledwie kwadrans i dawać całkiem ładny profil amplifikacji! (drobna uwaga: większość zwykłych termocyklerów nie ma możliwości technicznych, by oscylować pomiędzy temperaturą 50 stopni i 98 stopni w odpowiednich interwałach czasowych, więc takie reakcje prowadzi się w termocyklerach do qRT-PCR)

Kolejną ciekawą modyfikacją programu reakcji jest stosowanie tzw. „touchdown PCR„. Jest to ciekawa propozycja szczególnie dla osób, które chcą optymalizować multiplex PCR.

Stosujemy go jeżeli:

-mamy w mieszaninie reakcyjnej 2 pary starterów, z których jedna amplifikuje się preferencyjnie w wyższej temperaturze, a druga w niższej,

-gdy dana para starterów tworzy pary primer-dimer

-gdy w reakcji tworzą się oprócz produktu głównego także produkty niespecyficzne

Tradycyjnie w tych przypadkach możemy wybierać w  kwestii temperatury amplifikacji: albo amplifikujemy z gorszą wydajnością w wyższej temperaturze, albo godzimy się na niespecyficzną amplifikację/powstawanie dimerów starterów/nierówną amplifikację w multiplexie w niższej temperaturze.  Wyjściem pośrednim, niejako kompromisem jest sztuczka z „opadającym PCR”. Idea jest prosta: z każdym cyklem temperatura annealingu obniża się o zadeklarowaną ilość stopni celcjusza. Wobec tego w początkowych cyklach amplifikacja jest gorsza (bo temperatura wyższa niż optimum), ale faworyzowany jest wyłącznie specyficzny produkt. W kolejnych cyklach warunki amplifikacji są coraz łagodniejsze, dążą do optimum, ale ilość specyficznego produktu wygenerowanego w pierwszych cyklach w wyższej temperaturze jest na tyle duża, że ma on przewagę amplifikacji nad wszelkimi „śmieciami”, które mogłyby z nim konkurować, o ile nie zostałby zastosowany „touchdown”. Tym samym pomagamy żądanemu amplikonowi „wybić się” w tłumie niespecyficznych produktów reakcji.

Jeszcze inną, interesującą modyfikacją programu PCR jest „pomostowanie” annealingu i elongacji (tzw. „ramp-PCR„). Polega to w dużym skrócie na powolnym podwyższaniu temperatury annealingu do temperatury elongacji. Wówczas nie deklarujemy czasu trwania etapu annealingu, za to wyznaczamy jak „stromy” ma być pomost, np.możemy zastosować  „ramp” od 56 stopni do 72 stopni ze wzrostem temperatury co 1 sekundę o 0,1 stopnia albo o wiele szybszy, jeżeli będziemy zwiększać temperaturę o 0,5 stopień. Parametr „ramp” wpisywany jest zwykle do programu termocyklera jako %.

Co nam daje pomostowanie w PCR? Przede wszystkim może poprawić amplifikację specyficznego produktu, szczególnie dla primerów o bardzo różnej temperaturze annealingu. Są także matryce, które cechują się sekwencją repetytywną. Na takich sekwencjach polimeraza lubi się „jąkać”, „mieć czkawkę” lub „ślizgać się” (takie nazwy potoczne funkcjonują w różnych laboratoriach), tworząc niespecyficzne produkty o kilka par zasad mniejsze lub większe niż produkt główny. Jest to bolączką np. genotypowania polimorfizmu STR w kryminalistyce. Pomostowanie pomaga pozbyć się tych „zająknięć” (ang. „stuttter”), co jest kluczowe dla analiz sądowych. Poniżej przedstawiamy przykład takiego właśnie „zająknięcia”.

Rycina 1: Zjawisko „stutter” powoduje tworzenie się małych ilości produktów niespecyficznych o obniżonej  lub (rzadko) podwyższonej długości w stosunku do właściwego amplikonu. W tym przypadku jest to zanieczyszczenie o niewielkim znaczeniu, niedopracowana reakcja PCR może jednak spowodować „stutter” obciążający nawet o ponad 20% produkt amplifikacji! Źródło ryciny.

Tym oto sposobem  dobrnęliśmy do końca części trzeciej. W ostatnim odcinku zaprezentujemy chemiczne dodatki, które pomogą stopić trudne matryce, bogate w pary GC, podsumujemy też cały cykl artykułów. Dziś nie pozostaje mi już nic innego, jak życzyć Wam dalszych udanych optymalizacji.

Piśmiennictwo:

Doświadczenia własne

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry