Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 20 czerwca 2017

Liczba komentarzy: 0
Potencjalne zastosowania terapeutyczne edycji genów systemem CRISPR-Cas9

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Coraz częściej w fachowej literaturze biotechnologicznej pojawia się enigmatyczny akronim „CRISPR”. Najnowsze doniesienia bardzo entuzjastycznie opisują kolejne zastosowania rewolucyjnej metody edycji DNA, opartej o białko Cas9 i pewne nietypowe sekwencje palindromowe, szerzej znane właśnie jako „CRISPR”. Na czym polega owa metoda i jaki jest potencjał dla medycyny?

Kilka słów o edycji genów

Koncepcja edycji genów jest prawie tak stara, jak reakcja PCR. Celowe wprowadzanie konkretnych zmian sekwencji nukleotydowej służyło początkowo naukom podstawowym – eksperymentowano na hodowlach bakteryjnych przy wykorzystaniu zmienionych ex vivo wektorów plazmidowych i/lub bakteriofagów. Taka forma edycji genów nosiła miano ukierunkowanej mutagenezy (ang. site-directed mutagenesis) i została opisana w 1975 roku [1]. Wprowadzanie zmian było przez dziesięciolecia procesem żmudnym i mało wydajnym. Dynamiczny rozwój technik edycji genów nastąpił w ciągu ostatnich 5 lat, wraz z opracowaniem technologii edycji przy pomocy „talenów” (TALn) [2], a następnie systemu CRISPR.

System CRISPR-Cas9: wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej

Akronim CRISPR oznacza w wolnym tłumaczeniu “regularnie zgrupowane, oddzielone, krótkie sekwencje palindromowi” (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Rozwinięcie skrótu dobrze opisuje naturę tych fragmentów DNA – zostały one scharakteryzowane u E. coli a następnie u innych bakterii i ze względu na wyjątkową budowę i zakonserwowany charakter zwróciły uwagę badaczy. Ich funkcja okazała się ciekawa i budziła skojarzenia z interferencją RNA u eukariotów- jest to podobnie jak RNAi element „komórkowego układu immunologicznego”. Broni on gospodarza przed obcym, wirusowym materiałem genetycznym, niszcząc go przy współudziale enzymów nukleolitycznych Cas (najbardziej użyteczna dla nauki dla okazała się być nukleaza Cas9).

Najważniejszymi cechami systemu CRISPR-Cas9, które czynią go wyjątkowym narzędziem dla biologii molekularnej, są:

-Programowalność
-Łatwość ich zastosowania in vitro
-Wysoka specyficzność
-Duża wydajność transformacji
-Brak homologii z genami komórek eukariotycznych
-Możliwość zastosowania wielu celów w jednym eksperymencie

„Programowalność” sprawia, że odpowiednio zaprojektowany CRISPR potrafi rozpoznać niemalże dowolny fragment DNA i doprowadzić do jego przecięcia.

Specyficzność sprawia, że bardzo rzadko enzym Cas9 zbacza z trasy i dokonuje niepożądanego cięcia w innym miejscu, niż zadane. Wydajność cięcia jest bardzo wysoka, sięga ponad 70% [3]. CRISPR-Cas9 cechuje minimalizm- oczyszczony enzym Cas9 i pojedyncza cząsteczka syntetycznego RNA są w stanie dokonać cięcia w próbówce. Wprowadzając kilka RNA jednocześnie można wykonać kilka cięć. Brak homologii z komórkami eukariotycznymi eliminuje ryzyko interferencji z natywnymi, podobnymi białkami ssaczego gospodarza.

Od cięcia do edycji genów

Przecięcie DNA to oczywiście dopiero połowa sukcesu. Generowane przez CRISPR dwuniciowe pęknięcia są przez natywne, eukariotyczne systemy naprawy DNA eliminowane, głównie na drodze tzw. „naprawy sterowanej przez homologię”  (ang. homology driven repair, HDR). W komórce diploidalnej nietknięta nić stanowi matrycę do naprawy nici uszkodzonej. Przecięta przez Cas9 nić DNA jest poddawana obróbce enzymatycznej, polegającej na usuwaniu kilku nukleotydów z miejsca cięcia, generowaniu lepkich końców a następnie odbudowie brakującego fragmentu na drodze homologii. Jest jeszcze druga obiecująca możliwość, polegająca na wycinaniu całych egzonów lub jeszcze większych fragmentów genomu- zastosowanie dwóch typów CRISPR naraz, nacelowanych na leżące blisko siebie sekwencje DNA pozwala na całkowite usunięcie obszaru leżącego między nimi i sklejenie nici w mechanizmie niehomologicznego łączenia końców [4].

 System CRISPR-Cas9 i inne formy edycji genów jako najbardziej obiecująca forma terapii genowej

Główną trudnością, z którą borykają się badacze terapii genowych, jest transformacja komórek somatycznych, które nie są aktywne replikacyjnie i zwykle nie integrują konstruktów syntetycznych zawierających „lecznicze” sekwencje DNA.

CRISPR jest pod tym względem wyjątkowy, ponieważ bazuje na mechanizmach naprawy DNA, które są aktywne także w komórkach znajdujących się w fazie G0 cyklu komórkowego.

System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej
Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0
Fakt ten został potwierdzony empirycznie- u myszy z uszkodzonym genem dystrofiny udało się „wyleczyć” 62% komórek mięśniowych, co wystarczyłoby do częściowej regeneracji mięśni i zahamowania procesu chorobowego [5]. Pomysłów na terapeutyczne wykorzystanie systemu CRISPR-Cas9 jest bez liku- począwszy od leczenia wspomnianych defektów w genie dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne), poprzez korekcję mutacji prowadzących do dystrofii siatkówki [6], aż po leczenie nowotworów [7]. Terapie te są wciąż w fazie badań podstawowych ze względu na konieczność zastosowania wektora wirusowego w celu dostarczenia do organizmu pacjenta całej „maszynerii” CRISPR-Cas9. Już teraz jednak w domenę medycyny eksperymentalnej wkroczyły modyfikacje (przy pomocy TALenów) komórek pacjenta ex-vivo. W październiku ogłoszono sukces terapii u rocznej dziewczynki, chorej na oporną postać ostrej białaczki limfoblastycznej. Procedura DLI (infuzja limfocytów dawcy) została wykonany w oparciu o zmodyfikowane limfocyty T donora, w których syntezowane były zmienione antygeny, tzw. UCART19, rozpoznające komórki białaczkowe. O ile sam pomysł nie jest nowy, to wykorzystanie edycji genów było nowatorskie i pozwoliło na zwiększenie skuteczności procedury tam, gdzie zawiodły wszelkie inne formy leczenia [7]. Tak szybkie zastosowanie medyczne tej wciąż nowej i raczkującej technologii daje nadzieję na dynamiczny rozwój innych terapii opartych na edycji genów.

 Piśmiennictwo:

1. Flavell RA., Sabo DL., Bandle EF. et al. Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA.Proc Natl Acad Sci U S A. 1975; 72, 1: 367–371.

2. Moscou MJ., Bogdanove AJ. A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science, 2009; 326, 5959: 1501.

3.  In Vitro Cleavage Efficiency of sgRNAs Correlates with Functional Genome Editing inTarget Cells, TAKARA& CLoneTech TECH NOTE TAKARA & CLoneTech,

4. AddGene CRISPR guide

5. Ousterout DG., Kabadi AM., Thakore PI. et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 2015; 6: 6244.

6. Bakondi B., Lv W., Lu B. et al. In Vivo CRISPR/Cas9 Gene Editing Corrects Retinal Dystrophy in the S334ter-3 Rat Model of Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Mol Ther, online publication 19 January 2016.

7. Qasim W, Persis PJ, Samarasinghe S. et al. First Clinical Application of Talen Engineered Universal CAR19 T Cells in B-ALL. 57th Annual American Society of Hematology Meeting, Orlando 2015.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry