Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 26 listopada 2016

Liczba komentarzy: 0
Programy do projektowania siRNA

Autor wpisu
dr Krzysztof Olszak
dr Krzysztof Olszak

Zjawisko interferencji RNA poznane zostało stosunkowo niedawno, bo w latach 90. XX wieku. Bardzo szybko jednak doceniono jego rolę, bo już w 2006 roku za jego odkrycie Andrew Z. Fire oraz Craig C. Mello otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii. O tym, że decyzja o uhonorowaniu tego odkrycia jest słuszna może świadczyć duża ilość publikacji opisujących RNAi, jak również wiele prób wykorzystania go w terapii różnych chorób. Kluczowym elementem w procesie interferencji jest krótki dwuniciowy RNA. Wsparcie w jego przygotowaniu niosą programy pomagające w projektowaniu krótkich interferencyjnych RNA. Są to bardzo przydatne narzędzia, których zadaniem jest ułatwienie przygotowania RNA o takiej sekwencji i budowie, aby doprowadzić do wyciszenia wybranego genu.

Interferencyjne RNA zostało już zaprezentowane w dwóch artykułach opublikowanych na stronach Doliny Biotechnologicznej. Pierwszy z nich był omówieniem zjawiska interferencji RNA. W kolejnym artykule natomiast zostały omówione różne właściwości, o których warto pamiętać podczas projektowania krótkich RNA.

Warto przypomnieć, że podstawowym warunkiem prowadzącym do wyciszenia wybranego genu jest dokładne sparowanie antysensownej nici siRNA z docelowym mRNA.

Choćby częściowa niehomologiczność krótkiego RNA może być przyczyną niespecyficznego i nieplanowanego wyciszania innego genu niż planowany, czego skutkiem jest wystąpienie niepożądanych efektów (ang. off-target effects) [1]. W ostatniej fazie procesu interferencji RNA udział bierze dwuniciowy krótki RNA. Każda z jego nici zbudowana jest z 21 nukleotydów. Stwierdzono jednak, że można również wykorzystać w wyciszaniu genów także nieco inaczej zbudowane RNA. Warto przypomnieć w tym miejscu sisiRNA (ang. small internally segmented interfering RNA) – dupleks zbudowany z trzech nici: antysensownej liczącej 21 nukleotydów oraz dwóch krótkich zamiast jednej sensownej. W badaniach interferencji RNA wykorzystano też siRNA o strukturze spinki do włosów (ang. short hairpin – shRNA). Skutecznie zastosowano również nietypowe cykliczne siRNA (ang. dumbbell siRNA).

Projektując siRNA trzeba wziąć pod uwagę opisane powyżej i poprzednio uwarunkowania, jak również kilka innych dotyczących sekwencji krótkiego RNA [2].

Dobór sekwencji krótkiego RNA musi zapewnić homologię nici antysensownej z wybranym mRNA. Jednocześnie też dobierając sekwencję mRNA i siRNA należy brać pod uwagę dostępność nici mRNA, oraz czy wybrana sekwencja pozwoli zaprojektować poprawnie zbudowane krótkie RNA. Ważnym parametrem jest ilość par GC w projektowanym siRNA. W literaturze można napotkać dwa nieco różniące się zakresy. Pierwszy to przedział pomiędzy 31,6 a 57,9% [3], drugi natomiast mieści się w zakresie pomiędzy 36 i 52%. Pożądane jest by w przypadku nici antysensownej procent nukleotydów G i C na odcinkach od drugiego do siódmego oraz od ósmego do osiemnastego nukleotydu zawierał się pomiędzy 19 i 52%. Warto przy tym pamiętać, że pomiędzy 10 i 11 nukleotydem wypada miejsce gdzie następuje hydroliza sparowanej nici mRNA.
Sekwencje GGGG lub CCCC niosą ryzyko tworzenia się nie pożądanych struktur szpilkowych. Z kolei więcej niż trzy kolejne A lub U może być odczytane przez polimerazę III jako miejsce transkrypcji poli U [5].

Podstawą powstania i utrzymania odpowiedniej struktury RNA jest szereg zależności termodynamicznych określonych dla poszczególnych fragmentów RNA, jak i dla całej cząsteczki.

Z punktu widzenia termodynamiki najtrwalsza jest struktura o najniższej energii swobodnej, będącej sumą energii poszczególnych fragmentów struktury cząsteczki. Istotnym parametrem dla kwasów nukleinowych jest temperatura topnienia (TM – ang. melting temperature). Jest to temperatura, w której 50% badanego w próbie RNA lub DNA ulega denaturacji [6]. Dla siRNA wartość ta z reguły nie przekracza 20°C. Większa ilość par GC może zwiększyć stabilność struktury RNA. Z kolei duża ilość par AU będzie destabilizować dupleks. Co jest ważne w przypadku, gdy siRNA będzie wykorzystywane w temperaturze na przykład 37°C. Mało stabilny region ze względu na zależności termodynamiczne znajduje się pomiędzy dziewiątym i czternastym nukleotydem w dupleksie siRNA [7].

Podstawy przewidywania struktury RNA

Wymienione wyżej zależności zostały wykorzystane podczas opracowywania algorytmów, które stały się podstawą do stworzenia programów wspomagających projektowanie siRNA.
Narzędzia pozwalające generować możliwe wersje drugorzędowej struktury RNA są wykorzystywane od lat 90. XX wieku. W oparciu o zastosowany algorytm pozwalają one przewidywać budowę drugorzędową dla wybranych sekwencji RNA. Niektóre z tych programów oparte są na badaniu właściwości termodynamicznych RNA [8]. Program mając podaną sekwencję przelicza wartości energii swobodnej i proponuje różne wersje struktury drugorzędowej, jakie mogą powstać dla podanej sekwencji nukleotydów. Za przykład tego typu programu może posłużyć m-fold, który został opracowany przez zespół Michaela Zukera. Jest to program, który może być przydatny również w przypadku projektowania siRNA, aby dla wybranej sekwencji przetestować parametry termodynamiczne cząsteczki [9].
Programy wspomagające projektowanie siRNA mają za zadanie wspomóc dobór sekwencji RNA homologicznej do fragmentu mRNA. W ich przypadku algorytmy opracowane są nie tylko w oparciu o termodynamiczne podstawy istnienia dupleksów. Brane są też pod uwagę inne wspomniane właściwości siRNA.

Przegląd wybranych programów wspomagających projektowanie siRNA

BLOCK-iT™ RNAi designer

Program dostępny pod adresem https://rnaidesigner.lifetechnologies.com został udostępniony przez Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA), jako strona internetowa.
Daje on możliwość wyboru sześciu opcji różnych krótkich RNA. W tym miRNA i siRNA, specjalnych siRNA oferowanych przez firmę udostępniającą program. Możliwe jest także generowanie struktury szpilki do włosów shRNA.
Procedura działania została podzielona na pięć kroków:
1. Należy podać Accession number lub sekwencję nukleotydową.
2. Wybrać należy region mRNA: Otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame – ORF), 5’ UTR lub 3’UTR.
3. Wybrać organizm z pośród trzynastu możliwych na czele z człowiekiem dla porównania sekwencji w bazie BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool. Dzięki temu można sprawdzić czy wybrane siRNA nie będzie homologiczne względem innych genów, niż wybrany do wyciszenia.
4. Należy wybrać procent par GC. Możliwy wybór zamyka się w przedziale od 20 do 90%.
5. Wybór algorytmu. Do wyboru jest domyślny algorytm lub alternatywnie Tuschl’s Motif Pattern [10].
Długość siRNA jest ograniczona do 19 nukleotydów. W przypadku struktur szpilkowych do wyboru są trzy sekwencje pętli: GAGA, AACG i CGAA [5].

GenScript siRNA Target Finder

Program znajduje się na stronach GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ, USA) – https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai. Dostępny jest po zarejestrowaniu się i zalogowaniu na stronie http://www.genscript.com/. W programie istnieje możliwość ustawienia parametrów stosowanego algorytmu – metody (Statistical Model (pattern:AAN19) lub Machine Learning (pattern:N21)). Do wyboru jest procent udziału par GC – domyślnie jest to przedział 30-60%. Można wybrać maksymalną ilość otrzymywanych siRNA. Do wyboru jest też organizm i tkanki – z tym, że mimo większej listy wyboru różnych zwierząt baza jest dostępna dla człowieka, myszy i szczura. Na koniec przed rozpoczęciem sprawdzania siRNA należy wkleić sekwencję cDNA wybranego mRNA. Program generuje tylko siRNA o długości 21 nukleotydów. Dla struktur szpilkowych jest dostępna pętla TTGATATCCG [5].

Oligowalk for siRNA design

Program został opracowany przez zespół David H. Mathewsa z University of Rochester Medical Center. Dostępny jest pod adresem http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi
Działanie programu opiera się na przeliczeniu danych termodynamicznych związanych z hybrydyzacją nici antysensownej do mRNA niosącego gen przeznaczony do wyciszenia [11]. Obsługa programu jest bardzo prosta i sprowadza się do wpisania nazwy oraz sekwencji lub wysłaniu pliku z sekwencją w formacie fasta. Wadą programu jest brak aktualizacji od 2008 roku.

RNAi codex

Program został opracowany przez Cold Spring Harbor Laboratory. Dostępny jest pod adresem http://codex.cshl.edu/. Program jest opracowany pod kątem pracy z shRNA. Struktur szpilkowych można szukać korzystając z dostępnych opcji lub przez wysłanie pliku z sekwencją. Program ma ograniczenia. Wyszukiwanie ograniczone jest do sekwencji człowieka, myszy i szczura. Dostępne są tylko sekwencje pętli dwóch ludzkich miRNA mir-30 oraz mir-1. Długość ramienia shRNA liczy 21 par nukleotydów [12].

RNAi explorer

Kolejny z programów można znaleźć na stronie http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp. Został opracowany przez Gene Link Inc. (Westchester, NY, USA). Oddzielna strona jest przeznaczona dla shRNA: http://www.genelink.com/sirna/shRNAi.asp Obie jednak są do siebie podobne. Istnieje możliwość wprowadzenia danych o sekwencji w postaci GeneID, Accession Number. Można też przesłać plik lub wkleić samą sekwencję. Istnieją też opcje do wyboru udziału par GC. Jest tu wybór tylko między trzema podanymi zakresami: 30-40, 40-50 oraz 50-60%. Program generuje siRNA zawierające 19 par nukleotydów. W przypadku shRNA program jest bardziej rozbudowany. Są do wyboru trzy sekwencje pętli: TTCG, TCAAGAG, GAAGCTTG lub inna do samodzielnego wpisania. Długość shRNA jest również dostępna jako opcja do wyboru [5].

RNA Wizard v3.1

Program firmy InvivoGen jest dostęny pod adresem http://www.sirnawizard.com/design_advanced.php.
Wyróżnia się umieszczoną na górze prostą instrukcją obsługi. Pod nią jest miejsce na wpisanie nazwy, wklejenie sekwencji (maksymalnie: 9600bp) i ustawienie parametrów. Standartowo przewidziane jest siRNA zbudowane z nici po 21 nukleotydów, ale istnieje możliwość zmiany. Do wyboru są trzy
bazy danych dla mRNA i miRNA SEED. Wybór jest ograniczony do człowieka, myszy i szczura. W wersji rozbudowanej, którą można wybrać z bocznego paska można również wprowadzić ograniczenia dla wybranego regionu siRNA, można wybrać procentowy udział par GC. Również z bocznego paska można wybrać wersję programu pozwalającą zbudować z siRNA strukturę szpilkową. Domyślna sekwencja pętli to TCAAGAG [5].

siDesign Center

Ten program dostępny jest pod adresem: http://dharmacon.gelifesciences.com/design-center/. Znajduje się na stronie GE Healthcare Dharmacon Inc. Obsługa programu odbywa się w czterech krokach. Sekwencję można wprowadzić bądź podając jej dane np. Accession number, bądź też wpisując sekwencje w formacie fasta. W drugim kroku wybiera się region mRNA, który będzie miejscem hybrydyzacji nici antysensownej z mRNA. Do wyboru jest 5’ lub 3’ UTR lub ORF. W kroku trzecim wybiera się procentowy udział par GC. Jako domyślny proponowany jest przedział 30-64%. W kroku czwartym można skorzystać z sprawdzenia bazy BLAST. Program generuje siRNA złożone z 19 par nukleotydów. Dział pomocy dla użytkowników jest napisany bardzo szczegółowo zaczynając od wyjaśnienia podstawowych pojęć. Jest też przy tym bardzo przejrzyście ułożony, dzięki czemu początkujący użytkownik nie pogubi się w tej lekturze [5].

siDirect version 2.0

Ostatni z opisywanych szerzej programów znajduje się pod adresem http://sidirect2.rnai.jp/. Strona programu jest bardzo oszczędna i na początek pokazuje tylko miejsce na wpisanie accession number lub wklejenie sekwencji. Opcje dostępne są pod linkiem na dole strony. Program pozwala na wybór jednego z trzech algorytmów: Ui-Tei [13], Reynolds [4], Amarzguioui [3]. Możliwy jest też wybór jednej z trzech kombinacji wymienionych algorytmów. Można również regulować temperaturę topnienia, czy procentowy udział par GC. Bardzo przejrzyście opracowana została strona pomocy z graficznym przedstawieniem poszczególnych opcji [14].

Korzystając z wyżej prezentowanych lub innych dostępnych programów zazwyczaj projektuje się od trzech do pięciu dupleksów siRNA skierowanych na dany gen. W ten sposób można wybrać najaktywniejsze cząsteczki, nie powodujące niepożądanego wyciszania genów [15] Poza wymienionymi wyżej programami powstało jeszcze kilkanaście podobnych programów. Nie wszystkie z nich są obecnie dostępne. Zapewne każdy użytkownik będzie w stanie znaleźć taki program, który okaże się być wygodnym w obsłudze i jednocześnie będzie generował sekwencje siRNA spełniające wszystkie wymagania związane z wyciszaniem wybranego genu.

Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA
Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0
Przedstawione programy zostały opracowane przez grupy zajmujące się badaniami interferencji RNA lub przez firmy zajmujące się produkcją odczynników czy syntezą oligonukleotydów dla potrzeb biologii molekularnej. Prezentują różny poziom dostępności ustawień parametrów mających wpływ na jakość projektowanych siRNA. Programy bardziej rozbudowane są z pewnością trudniejsze do obsługi dla szczególnie dla użytkowników, którzy rozpoczynają swoją pracę przy projektowaniu siRNA. Z drugiej strony jednak większa liczba opcji do ustawienia przez użytkownika daje możliwość lepszego doboru sekwencji krótkiego RNA – takiej która będzie skutecznie wygaszała ekspresję tylko wybranego genu.

Piśmiennictwo

1.  Jackson AL. et al. Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006, 12, 7: 1179–1187.

2. Olszak K. Właściwości małych interferencyjnych RNA. Dolina Biotechnologiczna. 24.05.2016 http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/wlasciwosci-malych-interferencyjnych-rna/

3. Amarzguioui M. Prydz H. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 316, 1050-1058.

4. Reynolds A. Et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 326-330.

5. Fakhr E. et al. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 2016, 23, 4:73-82.

6. Freier SM. Et al. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec; 83(24): 9373–9377.

7. Khvorova A. Et al. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 2003; 115: 209–216.

8. Mathews DH. Et al. Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure.  J. Mol. Biol. 1999, 288, 911-940.

9. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 13, 3406-3415, 2003.

10. Elbashir S. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2004, 411, 6836: 494-8.

11. Lu ZJ, Mathews DH. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008. 36: W104–W108.

12. Olson A. Et al. RNAi Codex: a portal/database for short-hairpin RNA (shRNA) gene-silencing constructs. Nucleic Acids Research. 2005, 34, D153-D157.

13. Ui-Tei K. Et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 2004, 32, 936-948

14. Naito Y. Et al. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 2009, 10:392

15. Sierant M. Modyfikowane chemicznie dupleksy siRNA. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 146-172.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry