Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 16 czerwca 2016

Liczba komentarzy: 1
Real Time PCR — barwniki niespecyficzne

Technikę łańcuchowej reakcji polimeryzacji w czasie rzeczywistym można podzielić na metody specyficzne oraz niespecyficzne. Kryterium tego podziału jest rodzaj wykorzystywanego detektora kwasów nukleinowych — cząsteczki, która umożliwia emisję kluczowych w tej reakcji kwantów światła.

Zasada działania

Cząsteczkami pozwalającymi na pomiar niespecyficzny są fluorochromy, takie jak: bromek etydyny, jodek propidyny, czy najbardziej popularny: SYBR Green. Emitują one światło po związaniu się z dwuniciowym DNA, a amplifikacja docelowej sekwencji zachodzi jedynie dzięki obecności specyficznych starterów forward i reverse. Główną zaletą tej metody jest jej prostota, łatwość zaprojektowania starterów, jak i niski koszt wykonania, natomiast niezaprzeczalną wadą jest jej niska specyficzność (fluorochrom wiąże się także do struktur typu primer-dimer, jak i innych produktów obecnych w mieszaninie).

W przypadku stosowania detekcji niespecyficznej ważne jest przeprowadzenie po PCR reakcji dodatkowej w postaci pomiaru spadku fluorescencji w czasie „ „topienia” zamplifikowanej matrycy w celu sporządzenia tzw. krzywej topnienia (melting curve).

Reakcja ta polega na stopniowym podgrzewaniu mieszaniny i pomiarze fluorescencji (z reguły co 0,5°C), aż do momentu denaturacji DNA. Osiągniecie temperatury topnienia powoduje gwałtowny spadek fluorescencji, co przedstawione jest na wykresie w postaci piku. Dlatego też w przypadku amplifikacji w reakcji PCR tylko jednego specyficznego produktu uzyskuje się pojedynczy pik na krzywej topnienia. Konieczność przeprowadzania tej analizy wydłuża całościowy pomiar real time PCR od około 30 minut do nawet 2 godzin (w zależności od aparatury i zadanej przez użytkownika dokładności pomiaru).

O czym warto pamiętać

W przypadku wykorzystywania detekcji niespecyficznej do analizy ekspresji danych genów warto uwzględnić w pomiarze także kontrolę wewnętrzną. Kontrola taka to gen, który powinien ulegać podobnej ekspresji we wszystkich próbkach testowanych. Stosowana jest ona przy pomiarach typu względnej krzywej standardowej oraz porównawczego CT (ΔΔCT) w celu normalizacji fluorescencji analizowanego genu (genów). Przykładem takiej kontroli wewnętrznej mogą być geny konstytutywne, np. gen dla β-aktyny (mRNA), mGUS,  jak również geny dla rRNA.

Inną ważną kwestią, którą należy mieć na uwadze przy pomiarach PCR w czasie rzeczywistym, jest obecność barwnika referencyjnego. Barwnik taki jest również wzbudzany przez aparat, dzięki czemu powoduje emisję dodatkowej fluorescencji, która przy prawidłowym pomiarze powinna być jednakowa we wszystkich próbkach. Barwnik referencyjny jest używany w celu normalizacji sygnału, gdyż pozwala na uwzględnienie fluorescencji nie związanej z reakcją PCR (fluktuacje takie obecne są ze względu na minimalne różnice w objętości lub stężeniu reagentów w próbkach). Obecność takiej kontroli jest istotna dla precyzyjności pomiaru, a przykładem takiego barwnika jest ROX.

Projektowanie specyficznych starterów

Prawidłowo zaprojektowane startery do PCR w czasie rzeczywistym stanowią połowę sukcesu, w szczególności dla detekcji niespecyficznej). Dlatego też warto pamiętać o kilku podstawowych zasadach, takich jak:

* Długość amplikonu (dla optymalnej amplifikacji) powinna wynosić od 50 do 150 pz;

* Optymalna długość starterów to około 20 pz;

* Optymalna Tm starterów to 58 – 60°C;

* Zawartość GC starterów powinna wynosić od 30-80%;

* Koniec 3’ starterów nie może być bogaty w nukleotydy G lub C (nie więcej niż 2).

AM

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    „Koniec 3’ starterów nie może być bogaty w nukleotydy G lub C (nie więcej niż 2).” – należy zaznaczyć, że obecność 1-2 G/C jest zalecna na końcu 3′ primera (GC clamp)

    5 lat temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry