Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 08 stycznia 2013

Liczba komentarzy: 0
Test zestawów Thermo DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits

„Więc chodź, pomaluj mój świat na żółto i na niebiesko” – śpiewali 2+1. Myślę że to dobre motto dla nowych KITów do qPCR stworzonych przez Thermo. DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits to zestawy reagentów do ilościowego PCR, które wyróżniają się… no właśnie, kolorami.

Słowem wstępu

Thermo DyNAmo™ ColorFlash, produkowane pod banderą Finnzymes, to dwa zestawy, oparte o doskonałą chemię znaną ze wcześniejszych zestawów DyNAmo™. Zestawy te, co jest charakterystyczne dla tej marki, działają w oparciu o inną niż Taq polimerazę – enzym Tbr izolowany z pokrewnego do T. aquaticus gatunku bakterii.

Czym różni się DyNAmo ColorFlash od poprzedników? Ano właśnie kolorami reagentów- zarówno ROX, mastermix jak i bufor do rozcieńczania próbek są podbarwione kolorami, które nie zakłócają reakcji qPCR, ani odczytu fluorescencji. Ich spektra nie nachodzą na spektra typowe dla kanałów odczytu i wzbudzenia naszych termocyklerów.

Po co wprowadzono kolorowe odczynniki? W ramach odpowiedzi od razu nasuwa mi się skojarzenie serologiczne- odczynniki używane w oznaczaniu grup krwi są podbarwione na podobne kolory (żółć i błękit) by zapobiec pomyłkom w kolejności dodawania reagentów, które mogłyby być tragiczne w skutkach. Niby jest to niewielkie ułatwienie, na które „rutyniarze” laboratoryjni nie zwrócą wielkiej uwagi, ja jednak złapałam się na tym, że upewniałam się patrząc na kolor roztworu, czy wszędzie dodałam do gotowego mixu próbki cDNA rozcieńczonej żółtym buforem- to naprawdę potrafi usprawnić pracę, czego dowodem jest właśnie rutynowe zastosowanie podobnego pomysłu w serologii. Myślę że propozycja Thermo Scientific szczególnie przypadnie do gustu osobom, które dopiero zaczynają swoją przygodę z dużymi zestawami prób np. na płytkach 96 dołkowych.

Test zestawu DyNAmo™ Flash Probe qPCR Kit

Na pierwszy ogień wybrałam zestaw ColorFlash Probe, dedykowany pod sondy molekularne i pokusiłam się o amplifikację jednego z ludzkich genów konstytutywnych, GUSB. Obrany amplikon był dość typowy, ~100nt, 40% GC.

Przeprowadziłam reakcję qPCR dla seryjnych rozcieńczeń standardu dla tego genu, żeby ocenić parametry wydajności reakcji. Muszę przyznać, że zestaw zaskoczył mnie bardzo pozytywnie, na co wskazują ładne parametry krzywej standardowej.

Krzywa standardowa przygotowana w oparciu o zestaw ColorFlash  Probe

Kolejny test wykonałam, by porównać ColorFlash z dwoma, używanymi obecnie rutynowo w mojej pracy, zestawami znanych producentów. Próbki w dwóch powtórzeniach dla każdego reagentu, zawierające po ~15tys cząsteczek standardu GUSB, zostały poddane reakcji z tym samym stężeniem sond i starterów na standardowym programie 2-step (95 degC ->60 degC) x 45cykli.  Rezultat dla wszystkich reagentów był zbliżony, punkt Ct dla mojej najlepszej polimerazy był o 1 cykl niższy niż dla DyNAmo, za to Ct naszego zestawu do genotypowania spóźniał się w stosunku do DyNAmo o 1 cykl. Uznaję więc, że wszystkie 3 zestawy sprawdzają się równie dobrze, co pozytywnie świadczy o testowanym przeze mnie  zestawie Thermo.

Name

Ct

1

22,88

1

22,68

DyNAmo

20,95

DyNAmo

21,12

2

20,18

2

20,32

 

Test zestawu DyNAmo™ ColorFlash SYBR® Green qPCR Kit

Uznawszy, że wyniki dla zestawu Probe są satysfakcjonujące, przeszłam do testów ColorFlash SYBR Green, działającego w oparciu o poczciwy barwnik niespecyficzny. Amplifikowałam ten sam fragment genu co poprzednio, tym razem jednak z oczywistych względów bez dodatku sond.

Znów przeprowadziłam reakcję qPCR dla seryjnych rozcieńczeń standardu i oprócz krzywej (danych nie publikuję, ale parametry są zbliżone do tych z analizy zestawu Probe) wykonałam analizę krzywej topnienia.

Krzywe topnienia wykonane na serii rozcieńczeń dziesiętnych amplikonu GUSB. Krzywa turkusowa dla NTC wskazuje na formowanie par primer-dimer.

Zestaw wykazuje bardzo ładną, silną fluorescencję, barwnik jest stabilny w trakcie trwania reakcji, nie mam się do czego przyczepić- oceniam go pozytywnie.

Podsumowanie

Na rynku qPCR jest z czego wybierać. Każda większa firma produkuje swoje zestawy, które mają podobne parametry, dobrą wydajność i w zasadzie trudno się na cokolwiek zdecydować.

Jeżeli szukacie zestawu, który Was nie zawiedzie- możecie śmiało spróbować KITu z barwnej gamy produktów DyNAmo . Jeżeli macie pod opieką początkujących pracowników, tym bardziej kolorowe reagenty mogą być ciekawą propozycją, która pomoże „nowym” wdrożyć się w badania. Mogę jednak z czystym sumieniem zestawy polecić nie ze względu na kolory, ale dlatego, że po prostu dobrze się sprawdzają w typowych zastosowaniach. Do przeprowadzania reakcji opartych na SYBRze, do ilościowania na sondach i genotypowania końcowego (endpoint genotyping) śmiało można zakupić produkty Thermo Scientific.

Marzena Wojtaszewska

Dystrybutorem DyNAmo™ ColorFlash qPCR Kits jest firma ABO.

Name Type Ct Given Conc (copies/reaction) Calc Conc (copies/reaction) CT
1 Unknown 22,88 10000 10000 22,78
1 Unknown 22,68 11411,99
DyNAmo Unknown 20,95 35012,51 21,04
DyNAmo Unknown 21,12 31391,86
2 Unknown 20,18 57911,63 20,25
2 Unknown 20,32 53040,04
image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry