Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 01 marca 2016

Liczba komentarzy: 1
Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR – algorytm postępowania

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać?

Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR.

Schemat optymalizacji

A. Zawsze po zamówieniu nowych starterów PCR zaczynamy od nastawienia próbnej reakcji– od jej wyniku będzie zależało dalsze postępowanie.  Musimy znać temperaturę annealingu starterów (albo obliczoną teoretycznie, albo używaną przez inne grupy badawcze, jeżeli nasze startery są zamówione na podstawie już publikacji).

Jeżeli korzystaliśmy wcześniej z danego zestawu do PCR, mamy już jakiś działający program amplifikacji i ustalone proporcje reagentów -wykorzystajmy je teraz. Jeżeli jesteśmy nieobeznani z zestawem, przeczytajmy ulotkę i na jej podstawie obliczmy ilości odczynników.

Zwykle musimy w końcowej objętości mieć:

* bufor 1x stężony

* dNTP  200μM

* MgCl2 1-2,5mM

* startery po 200nM

* polimerazę ok. 0,5-1U

* matrycę:  DNA w ilości 25-50 ng lub cDNA uzyskane z ok. 50-100ng RNA

* wodę DEPC, którą uzupełniamy objętość reakcji.

(nie podajemy tutaj konkretnych objętości, ponieważ zależnie od zastosowanego zestawu PCR będą one różne, w instrukcji do zestawu jest jednak zwykle wyszczególniony przepis w mikrolitrach)

B. Jeżeli nie mamy ustalonego programu PCR, zastosujmy najprostszy, obejmujący :

*5 minut denaturacji w 94 stopniach (jeżeli polimeraza nie jest typu HotStart) lub 10 minut w 95 stopniach (dla enzymu HotStart)

*30 cykli: (30 sekund denaturacji+ 30 sekund annealingu w temperaturze zależnej od pary starterów + 30 sekund elongacji)

*2 minuty elongacji końcowej.

C. Po skończonej reakcji pobieramy 5ul, dodajemy obciążnik do elektroforezy i rozdzielamy na żelu agarozowym. Nie zapomnijmy rozdzielić produktu wobec markera mas, by móc zorientować się, czy otrzymany prążek jest tym, czego oczekiwaliśmy.

W zależności od tego, czy otrzymamy prążek na żelu, postępujmy dalej zgodnie z poniższym algorytmem

By uniknąć frustracji i niepotrzebnego „kręcenia się w kółko” podczas wprowadzania nowej metodyki opartej na reakcji PCR powinniśmy mieć jasny plan działania i przestrzegać kilku prostych zasad.

1. Stosujmy się do reguły małych kroków. Dążymy w pierwszej kolejności do otrzymania jakiegokolwiek śladu produktu, następnie powoli dopracowujmy reakcję korzystając po kolei ze wszelkich dostępnych metod i odczynników. Czasami od razu uda nam się trafić w idealne warunki, a czasem trzeba będzie dochodzić do nich dłużej.

2. Zapisujmy wszystkie żele, nawet te najbrzydsze. Sporządzajmy notatki dotyczące warunków reakcji i kolejnych rund optymalizacji.  Moim zdaniem najlepsza metoda na takie notatki to zapisywanie bezpośrednio na elektronicznym zdjęciu żelu warunków, w jakich reakcja została wykonana. Czyli: kiedy ją wykonano, na jakim sprzęcie, na jakim zestawie do PCR (jeśli mamy kilka). Zapiszmy program PCR lub chociażby temperaturę annealingu oraz koniecznie stężenie magnezu. Jeżeli używaliśmy dodatków (np. DMSO) także nie zapomnijmy tego napisać.

3. Zanim zabierzemy się do nastawiania PCR zweryfikujmy stężenia naszych reagentów, ich termin ważności  oraz (TO BARDZO ISTOTNE!) sprawdźmy sekwencje naszych starterów. Jeżeli pomyliliśmy się podczas zamawiania, zweryfikowanie tego drobnego szczegółu oszczędzi nam tygodni frustracji.

4. Jeśli jakaś metoda „nie chodzi” mimo wszystkich naszych działań, nie wypruwajmy sobie żył. Spróbujmy zmienić startery albo zestaw do PCR. Alternatywą jest poproszenie współpracownika o pomoc. Bywa że to pomaga 🙂

D. Bogatsi o tę wiedzę możemy zacząć optymalizację. Spójrzcie na powyższy prosty schemat blokowy, którym możecie się posłużyć przy wprowadzaniu większości nowych reakcji.

Podstawowym narzędziem pracy podczas optymalizacji jest gradient termiczny i gradient magnezu. Pozwalają one na wykonanie dokładnie tej samej reakcji w szeregu różnych temperatur i stężeń magnezu.

Wykonanie gradientu temperatury jest możliwe na nowszych termocyklerach. Potrafią one nagrzać blok grzewczy tak, by w kolejnych rzędach dołków temperatura stopniowo wzrastała. Żeby uzyskać jednolite warunki PCR w każdej próbówce, musimy przygotować wspólną mieszaninę reakcyjną zawierającą wszystkie składniki, a potem rozporcjować ją na pojedyncze próbówki.

Polecam wykonać na początku dość „szeroki” gradient, np. co 2 stopnie celcjusza zaczynając od temperatury dużo  niższej  od temperatury obliczonej jako optymalna (np. 0d ok. 50 stopni celcjusza przy optymalnej ok. 60), kończąc na temperaturze wyższej niż obliczona optymalna (np. 62 w naszym przykładzie). Jeżeli taki gradient da odpowiedź, w której temperaturze produkt jest najlepiej widoczny, możemy wykonać drugi PCR gradientowy w węższym zakresie temperatur, np. co ok. 1 stopień celcjusza wokół wcześniej wytypowanej przez nas optymalnej temperatury.

E. Zwykle po pierwszej lub drugiej reakcji PCR otrzymujemy jakiś ślad pożądanego produktu, nawet jeśli jest on słaby i nawet jeśli są obecne produkty niespecyficzne. Po dokonaniu wyboru optymalnej temperatury, wykonujemy gradient magnezu. Przygotowujemy kilka próbówek PCR z różnymi stężeniami magnezu. Może to być trudne dla początkującego, proponuję więc poradzić się osoby bardziej doświadczonej, jeżeli mamy z tym problem. W próbówce nr 1 przygotujmy stężenie, które po dodaniu do MIXu da nam  0,5mM, w próbówce 2:   1mM, w próbówce 3 : 1,5mM itd. aż do 3,5mM ((instrukcja znajduje się u dou strony).  Wykonujemy wspólny mix reakcyjny podobnie jak przy gradiencie temperatury, ale bez dodatku magnezu. Pipetujemy mieszaninę do osobnych próbówek, a potem dodajemy odpowiednio stężony magnez, osobno do każdej z próbówek.

F. Po wykonaniu reakcji w gradiencie magnezu i rozdziale agarozowym produktów w 3/4 przypadków udaje nam się uzyskać w miarę czysty i dobrze widoczny produkt. W pozostałych przypadkach musimy wrócić do gradientu temperatury z już wybranym optymalnym stężeniem magnezu (o ile uda nam się takie wybrać).

Jeżeli nie liczymy się z kosztami, możemy wykonać jednocześnie gradient 2D na płytce 96-dołkowej (w wymiarze szerszym gradient termiczny, w węższym-  magnezu). Przeprowadzenie kolejne obu gradientów jest tańsze, ale bardziej czasochłonne niż wykonanie podwójnego gradientu.

Jeżeli nie otrzymaliśmy w ogóle żadnego produktu, wykonajmy na użytych do optymalizacji odczynnikach inną reakcję PCR, o której wiemy że działa. Jeśli okaże się że równieżnie otrzymamy produktu, musimy zmienić zestaw do PCR, w przeciwnym razie dalej zmagamy się z optymalizacją na tych samych odczynnikach- możemy dodać więcej starterów lub więcej dNTP. O tym jak modyfikować te parametry i jak  połaczyć kilka reakcji PCR w multiplex, przeczytacie w części III naszego opracowania.

Jeżeli nie otrzymujemy produktu, możemy także dodać któregoś z dodatków do trudnych matryc (DMSO, betaina, DTT, albumina). O tym jak z nich korzystać- dowiemy się w części IV niniejszego cyklu artykułów.

Życzymy samych udanych optymalizacji!

*Krótka instrukcja wykonania gradientu (przykład dla reakcji o całkowitej objętości 25μl):

Dodatek 3,5μl MgCl2 o standardowym stężeniu 25mM na 25μl całkowitej objętości reakcji daje nam finalne stężenie po sporządzeniu MIXu 3,5mM MgCl2. Żeby przygotować stężenia odpowiednio mniejsze w tej samej objętości 3,5μl, wystarczy odmierzyć odpowiednio mniej magnezu i uzupełnić wodą do 3,5μl. Tak więc żeby otrzymać:

* 0,5mM końcowej reakcji dodajmy 0,5 μl MgCl2 + 3μl H20

* 1mM : 1μl MgCl2 + 2,5μl H20,

* 1,5mM: 1,5μl MgCl2 + 2μl H20

*2mM: 2μl MgCl2 + 1,5μl H20

*2,5mM: 2,5μl MgCl2 + 1μl H20

*3mM: 3μl MgCl2 + 0,5μl H20

Osobno mix reakcyjny na 7 próbówek przygotowujemy bez magnezu o objętości 3,5μl, który mamy sporządzony zgodnie z powyższą instrukcją w 7 osobnych próbówkach. Mix dobrze mieszamy i dozujemy po 21,5μl do gotowych stężeń magnezu.

Można oczywiście sporządzić większą objętość magnezu na więcej reakcji gradientowych (np. mnożąc objętości z powyższego przepisu x10) i odmierzać po 3,5μl gdy najdzie nas taka potrzeba.

Piśmiennictwo:

Doświadczenia własne

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    Bardzo dobry poradnik. Dzięki! 🙂

    3 lata temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry