Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 09 grudnia 2016

Liczba komentarzy: 0
Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC?

Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą opcję wobec tego wybrać?

Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane komputerowo.  Nić DNA jest w nich „produkowana”  w kierunku 3’ ⇒ 5’, każda zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych. Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100% wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych, krótszych oligo.

Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1% reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych łańcuchów (54%-74%),  a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe, 28-merowe itd.  Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego produktu syntezy.

Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz).

Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia odwróconej fazy („Cartdridge”) , wysokoprężna chromatografia cieczowa (HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa

*     Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qPCR.

*     Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok. 80-90% żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też niższy odzysk  oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy. Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).

*     Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%).  Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt).

*     Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne.

*     Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie  dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych.  Filtracja żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA. Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale wymywając niezwiązany z sondą barwnik.

Marzena Wojtaszewska

Chromatografia czy sączenie żelowe?
wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań
Źródło:

Life Technologies

SigmaAldrich

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry