Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 08 lutego 2016

Liczba komentarzy: 0
Optymalizacja reakcji PCR. Część I: podstawy

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać?

Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR.

PCR jest metodą o wiele bardziej złożoną, niż na to wygląda!
Źródło: Wikimedia Commons, autor George Church, licencja CC BY SA 3.0

1. Podstawy -przede wszystkim należy zapoznać się z podstawowymi składnikami MIXu reakcyjnego.

* Bufor : zawiera zoptymalizowany dla danej polimerazy skład jonowy, warunkujący odpowiednią konformację enzymu podczas reakcji, wspomaga inkorporację zasad, sprawia że DNA łatwiej uzyskuje liniową strukturę i nie tworzy skomplikowanych struktur drugorzędowych.  Bufor jest dostarczany jako tzw. stock, stężony 2x, 5x lub 10x. W związku z tym musimy pamiętać o otrzymaniu odpowiedniego stężenia końcowego tego odczynnika. Obecnie większość buforów zawiera KCl lub Na2SO4 rozpuszczone w zbuforowanym roztworze opartym o TRIS. Niektóre bufory zawierają już pewną ilość jonów Mg2+,  koniecznych jako kofaktor reakcji, inne są ich pozbawione i na to trzeba wziąć poprawkę podczas dostosowywania metodyki literaturowej do swoich potrzeb.  Innym udogodnieniem jest obciążanie buforu do PCR odpowiednimi neutralnymi barwnikami do elektroforezy, dzięki którym można od razu po PCRze nakrapiać produkt na żele agarozowe. Niektórzy producenci produkują KITy dedykowane do konkretnych zastosowań, wówczas skład buforu jest modyfikowany np. w celu łatwiejszego topienia matryc bogatych w GC (więcej na ten temat w rozdziale 4: Dodatki do trudnych matryc)

* MgCl2: jony magnezu są kofaktorem polimerazy, ich rola jest nie do przecenienia. Im wyższe stężenie Mg2+ tym silniejsze oddziaływanie matryca-enzym, tym wydajniejsze wiązanie starterów i tym niższa optymalna temperatura reakcji. Podwyższenie ilości MgCl2 zwykle dodatnio wpływa na reakcje multiplex i allelospecyficzny PCR. Może jednak spowodować powstawanie niespecyficznych produktów reakcji. Niestety każda matryca cechuje się innymi wymaganiami magnezowymi i należy znaleźć empirycznie idealne stężenie dla naszego KITu i naszego amplikonu.

*dNTP: trifosforany deoksyrybonukleozydów to paliwo i jednocześnie substrat reakcji amplifikacji. Obecnie najczęściej dostarczane są w KIT’cie jako mieszanina dATP, dGTP, dCTP i dGTP. Wysokoenergetyczne trojfosforany są dość labilne w temperaturze pokojowej, dlatego dobrze jest dbać o to, by nie były poddawane częstym cyklom rozmrażanie-zamrażanie, oraz by były trzymane na lodzie podczas składania reakcji PCR.

* startery (primery):  czynnik decydujący o tym, co amplifikujemy. Sekwencja starterów, odpowiednio zaprojektowanych dla danego amplikonu, jest komplementarna (w pełni albo przynajmniej w obrębie kilku(nastu) pierwszych nukleotydów od końca 3′) do naszej matrycy i w odpowiedniej temperaturze annealingu umożliwia hybrydyzację i prymowanie reakcji dla polimerazy. Jest to kluczowe, ponieważ enzym nie przyłączy się do fragmentu jednoniciowego i nie zacznie amplifikacji bez oligonukleotydu, który niejako jest dla niego kotwicą na matrycy. Najczęściej korzystamy ze starterów w równych stężeniach, jednakże w przypadku primerów o różnych długościach, różnej zawartości par GC czy też różnej autokomplementarności można stosunek ich stężeń zmieniać, by otrzymać optymalną amplifikację.

* polimeraza DNA: najważniejszy enzym w biologii molekularnej! Enzym jest  izolowany z termofilnych bakterii i rekombinowany dla zwiększenia termostabilności, efektywności i wierności amplifikacji. Obecnie rodzajów polimeraz w handlu jest kilkaset (jeśli nie więcej!). Niektóre posiadają specjalne własności: brak aktywności 3′->5′ nukleolitycznej, aktywność korekcyjną proof reading, czy też odporność na wysokie temperatury topnienia (98-99 stopni). Dla podstawowej amplifikacji wystarczy jednak zwykły, poczciwy Taq.

* woda ultraczysta – do mieszaniny reakcyjnej do PCR nie możemy dodawać wody z kranu. Musi to być woda odwrotnie osmozowana, pozbawiona jonów soli w znaczący sposób mogą wpływać na niepowodzenie reakcji. Poza czystością chemiczną, woda musi być wolna od mikroorganizmów i zanieczyszczeń enzymatycznych, które powodują degradację matrycy (np. ciepłostabilnyvh DNAz bakteryjnych)

* matryca – zwykle jest to oczyszczone DNA lub cDNA, jednakże dostępne rynku zestawy umożliwiają także korzystanie bezpośrednio z lizatu komórkowego jako matrycy. Wydajność reakcji PCR zależy bardzo silnie od jakości zastosowanego kwasu nukleinowego, jego stężenia oraz obecności zanieczyszczeń takich jak rozpuszczalniki organiczne lub sole.

W kolejnej części cyklu odpowiemy na pytanie, od czego zacząć podczas wprowadzania nowej metodyki i jak modyfikacja stężeń wymienionych reagentów może wpłynąć (pozytywnie lub negatywnie) na końcowy wynik reakcji.

Piśmiennictwo:

Doświadczenia własne

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry