Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 27 maja 2013

Liczba komentarzy: 0
Perpetual OptiTaq – znakomita polimeraza typu Hot Start

Przetestowaliśmy polimerazę Perpetual OptiTaq od Eurx. Ku naszemu zaskoczeniu okazało się, że polimeraza ta, która jest tańsza niż polimeraza AmpliTaq Gold (Life Technologies), pracuje bardzo zadawalająco. Perpetual OptiTaq jest ok. 4x dokładniejsza od zwykłej polimerazy Taq. Nasz test dowodzi, że przy tej samej ilości jednostek w przypadku Perpetual OptiTaq uzyskuje się lepszą amplifikację niż w przypadku Polimerazy AmpliTaq Gold od Life Technologies.

Przejscie na polimerazę Perpetual OptiTaq jest praktycznie bezproblemowe i wymaga tylko nieznacznej modyfikacji protokołu zgodnie z zaleceniami producenta – zwykle jest wymagane zastosowanie wyższej temparatury annealingu.

Perpetual OptiTaq polimeraza DNA HOT START to mieszanina termostabilnej Taq polimerazy DNA, Pfu polimerazy DNA o aktywności naprawczej, przeciwciał monoklonalnych anti-Taq, odwracalnych inhibitorów oraz czynników stymulujących do przeprowadzania reakcji „hot start” PCR.

Porównanie wyniku amplifikacji produktu PCR 170bp dla próbek 1-6. Prążki uzyskane przy użyciu Perpetual OptiTaq są nieco intensywniejsze.

Mieszanina umożliwia syntezę dużych (nawet ponad 20 kz) fragmentów DNA z wysoką wiernością matrycy.

Definicja jednostki: Jedną jednostkę enzymu definiuje się jako taką jego ilość, jaka niezbędna jest do przeprowadzenia reakcji katalizy inkorporacji 10 nmoli dNTP do nierozpuszczalnego w kwasie materiału, w czasie 30 min. i temperaturze 74°C.

Warunki reakcji: 50 mM Tris-HCl (pH 9.0 w 25°C), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 200 μM każdego z dATP, dCTP, dGTP, dTTP (mieszanina nieznakowanych i [³H]dTTP), 10 μg DNA z grasicy cielęcej oraz 0.1 mg/ml BSA , w całkowitej objętości 50 μl.

Warunki przechowywania: Przechowywać w –20°C.

Perpetual OptiTaq polimeraza DNA to mieszanina najwyższej jakości termostabilnej polimerazy DNA izolowanej z Thermus aquaticus (Taq), polimerazy DNA izolowanej z Pyrococcus furiosus (Pfu) , przeciwciał monoklonalnych anti-Taq, odwracalnych inhibitorów oraz czynników stymulujących przeprowadzaną reakcję polimeryzacji.

Do przygotowania Perpetual OptiTaq polimerazy DNA użyto wyłącznie białek wysokiej czystości.

Starannie wyselekcjonowane przez nas przeciwciała anti-Taq są wysoce stabilne w podwyższonych temperaturach, zapobiegając w ten sposób nie-specyficznej polimeryzacji, mogącej zachodzić w zakresie temperatur od temperatury pokojowej, aż do 70°C.Formowanie się kompleksów pomiędzy Taq polimerazą DNA oraz przeciwciałami anti-Taq stanowi podstawę reakcji „hot start” PCR, która pozwala na bezpieczne mieszanie wszystkich składników reakcji PCR w temperaturze pokojowej bez ryzyka otrzymania produktów niespecyficznych.

Wysoka stabilność kompleksów polomeraza-przeciwciało przyczynia się do wzrostu specyficzności i wydajności przeprowadzanej reakcji PCR.

Reakcja „hot start” PCR jest szybką, wydajną i bardzo wygodną metodą na przeprowadzenie reakcji PCR na kilku próbach jednocześnie.

Preparat katalizuje reakcję polimeryzacji nukleotydów w kierunku 5´->3´ w obecności jonów magnezowych, wykazując przy tym aktywność naprawczą w kierunku 3´->5´, dzięki czemu uzyskuje się znacznie wyższą wierność replikacji sekwencji DNA niż w przypadku użycia niezmodyfikowanej polimerazy.

W porównaniu z Taq polimerazą DNA umożliwia uzyskanie większej wydajności reakcji amplifikacji.

Posiada aktywność 5´->3´ egzonukleazy. Dodaje A na końcach 3′. Z uwagi na wysoką specyficzność, tolerancję zmian w stężeniu soli, jonów magnezowych oraz wartości pH, Perpetual OptiTaq polimeraza DNA jest szczególnie polecana do przeprowadzania reakcji PCR na kilku próbach jednocześnie. Umożliwia uzyskanie lepszych wyników PCR, szczególnie przy amplifikacji DNA z tzw. trudnych matryc (z regionami bogatymi w pary GC, palindromami lub wielokrotnymi powtórzeniami).

Perpetual OptiTaq polimeraza DNA polecana jest do stosowania we wszystkich reakcjach amplifikacji DNA metodą PCR. Umożliwia otrzymanie produktów DNA o bardzo szerokim zakresie wielkości, aż do 20 tys. par zasad.Bufor do przechowywania: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 w 22°C), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 50% glicerol oraz stabilizatory.

Bufor do reakcji:10 x Pol Buffer A (bufor optymalizacyjny bez MgCl2): bufor pozwala na optymalizację stężenia MgCl2 w reakcji.

10 x Pol Buffer B (bufor podstawowy, dla produktów o wielkości do 20 kz): bufor zawiera 15 mM MgCl2 i jest optymalizowany dla stężenia 0.2 mM każdego z dNTP.10 x Pol Buffer C (kolorowy): 10 x Pol Buffer B wzbogacony w dwa barwniki i czynnik obciążający. Barwniki umożliwiają śledzenie pozycji DNA na żelach, podczas elektroforezy. Bufor umożliwia bezpośrednie nanoszenie reakcji PCR na żel agarozowy.Kontrola jakości: Wszystkie preparaty sprawdzane są pod kątem zanieczyszczenia endonukleazami, 3′-egzonukleazami i niespecyficznymi DNazami wykazującymi aktywność względem jedno- i dwu– niciowego DNA. Oceniane za pomocą elektroforezy białek w obecności SDS, wykazują czystość wyższą niż 95%.

Literatura:

1.Cline, J., Braham, J. i Hogrefe, H. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 3545.

2.Chien, A., Edgar, D.B. i Trela, J.M. (1976) J. Bacteriol. 127, 1550.

3.Kaledin, A.S., Sliusarenko, A.G. i Gorodetskii, S.I. (1980) Biokhimiya 45, 644.

Eurx-logo

 

 

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry