Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 09 kwietnia 2016

Liczba komentarzy: 0
Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Trudne matryce

Autor wpisu
dr n. med. Marzena Wojtaszewska
dr n. med. Marzena Wojtaszewska

Jak przeprowadzić „optymalizację” reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać?

Prezentujemy ostatnią część cyklu, w którym tematem przewodnim będą tzw. „trudne matryce”

Czym jest trudnotopliwa matryca i jak można wspomóc polimerazę podczas amplifikacji takiej sekwencji?

Trudno o jednoznaczną definicję „trudnej” matrycy. Z reguły jednak problemy w amplifikacji biorą się z dużej zawartości motywów repetytywnych w sekwencji, a zwłaszcza traktów bogatych w pary GC.

Jak rozpoznać taką „złośliwą matrycę”? Można posiłkować się dostępnymi w sieci narzędziami, obliczającymi lokalną zawartość par GC w danym amplikonie.  Szczególnie przydatne są programy, które potrafią wyrysować nam wykres topliwości.

Znalazłam 4 działające programy tego typu.

Pierwszy to stare, DOS’owe narzędzie Melt94, które można pobrać tutaj.

Program na zadanej matrycy wykonuje analizę topnienia in silico, a wynik zwraca w formie serii liczb. Żeby otrzymać przejrzysty wynik, trzeba niestety samodzielnie przekopiować ciąg liczb do arkusza kalkulacyjnego, ale taki wykres może nam się później przydać, np. do publikacji na posterze lub w pracy dyplomowej, dlatego właśnie z niego korzystam i gorąco polecam.

Ryc. 1. Okno wynikowe programu Melt94. Na osi rzędnych naniesiono kolejne aminokwasy, na osi odciętych- zakres temperatur.

Kolejne algorytmy są dostępne w formie online. Są to:

GC Profile

Gene analysis

Loopentropy

Są to proste programy, szacujące %GC , które podobnie jak Melt94 rysują wykres topnienia amplikonu.

Co z takiego programu możemy wyczytać? Przede wszystkim informację, czy w matrycy znajdują się obszary o wysokiej (>80%) zawartości par GC. Jeśli tak, sprawdźmy czy nasze primery nie cumują właśnie w obrębie takiej „wyspy CG”. Jeśli  tak, to od razu powinniśmy uznać taką matrycę za kłopotliwą i pogodzić się z tym, że może zajść konieczność uciązliwej optymalizacji w celu otrzymania produktu PCR. Uwaga ogólna: czasami zdarza się, że sam PCR nie stanowi problemu, ale np. klonowanie lub sekwencjonowanie takiego produktu jest awykonalne bez zmian w metodyce (przekonałam się o tym na własnej skórze!).

Gdy jesteśmy gotowi do rozpoczęcia optymalizacji, postępujemy tak jak w II części naszego cyklu: próbujemy dobrać odpowiednią temperaturę topnienia i stężenie magnezu w gradiencie.  Jeżeli jesteśmy w stanie otrzymać w miarę wyraźny specyficzny produkt, w zasadzie nie musimy obawiać się o dalszą optymalizację. Jeżeli natomiast efektem amplifikacji jest smear, albo obecne jest wiele różnych produktów niespecyficznych, lub co gorsza nie jesteśmy w stanie otrzymać w ogóle produktów amplifikacji, to możemy mieć problem.

Co dalej?

Najprostszymi zabiegami, wspomagającymi słabą amplifikację są: wydłużenie denaturacji wstępnej, podwyższenie temperatury annealingu lub zastosowanie zabiegów z III części cyklu, głównie touchdown PCR-u. Gdy te środki zawiodą, musimy posiłkować się specjalnymi KIT-ami do trudnych matryc (wiele takich zestawów jest dostępne na polskim rynku) albo wypróbowanymi dodatkami, poprawiającymi efekty PCR (gotowe KIT-y także zawierają te same substancje!). Poniżej przedstawiam najpopularniejsze odczynniki tego typu.

DMSO – dimetylosulfotlenek ma wiele zastosowań, przede wszystkim krioprotekcyjnych, ale także niwelujących oddziaływania międzycząsteczkowe. Ta druga właściwość sprawia, że podczas ochładzania rozplecionych nici DNA na etapie annealingu nie dochodzi do pełnego formowania się struktur II-rzędowych w DNA. W związku z tym polimeraza ma dostęp do luźniej uorganizowanych fragmentów zawierających trakty GC, które byłyby niedostępne i ciasno zwinięte gdyby DMSO w mieszaninie reakcyjnej nie było. Stężenie końcowe DMSO w MIX’ie powinno wynosić nie więcej niż 10%, z reguły stosuje się go od 2 do 5%.

Betaina – jest osmolem organicznym o charakterze jonu obojnaczego. Sądzi się, że jej rola w PCR jest podobna jak DMSO- zmniejsza formowanie się struktur II-rzędowych. Ponadto stabilizuje kompleks polimeraza-DNA. Najczęściej dostarczana jest ona w stężeniu 5M, a używana jako 1-3M. Wiele firm sprzedaje betainę jako cudowny środek własnego pomysłu pod różnymi nazwami handlowymi, np. Q-solution (QIAGEN), Advantage-GC (CLONETECH).

DTT– ditiotreitol to antyoksydant, zwiększający stabilność polimerazy podczas reakcji PCR dzięki swoim własnościom redukującym. Obecnie częściej niż do PCR wykorzystywany w reakcjach RT-PCR.

Albumina- środek blokujący wiele białek, który nie wiąże się z polimerazami. Przydatna szczególnie w reakcjach PCR, zachodzących w obecności zanieczyszczeń białkowych (np. bezpośredni PCR na lizacie, PCR na materiale antycznym). Wspomaga też utrzymanie nici DNA w formie zdenaturowanej, co może tłumaczyć jej zastosowanie przy trudnotopliwych matrycach.

Formamid-używany jako środek denaturujący DNA, w niskich stężeniach obniża ilość struktur drugorzędowych. Niestety zastosowany w zbyt wysokim stężeniu powoduje unieczynnienie polimerazy, więc musi być stosowany w jak najmniejszych ilościach. Zaleca się końcowe stężenie 1-2,5% tego reagentu.

Detergenty niejonowe – substancje takie jak Triton, NP40 czy Tween działają stabilizująco na polimerazę i częściowo na matrycę. Mogą działać dodatnio także w reakcjach zanieczyszczonych odczynnikami organicznymi (np. po kiepskiej izolacji kwasów nukleinowych).

Glikol etylenowy, 1,2-propanodiolChińczycy ogłosili światu, że glikol i propanodiol działają podobnie do betainy, ale z dużo wyższą skutecznością. Warto spróbować, jeżeli nie mamy nic do stracenia!

melt
Uwagi końcowe

Niestety jedynym sposobem na przekonanie się, czy któryś z dodatków dla trudnych matryc będzie skuteczny w konkretnym przypadku, jest wypróbowanie go (i to w szeregu stężeń i konstelacji z innymi). Kiedyś odkryłam, że jeden z amplikonów nie chce poddać się reakcji PCR ani w obecności samego DMSO, ani samej betainy, natomiast wybornie działa zastosowanie obu tych substancji jednocześnie. Potraktujmy optymalizację PCR jako przygodę, doświadczenie które wzbogaci nasz warsztat i pozwoli na wyrobienie pewnych rutynowych nawyków podczas pracy z kolejnymi matrycami.

Piśmiennictwo:

Doświadczenia własne

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry