Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 20 lipca 2012

Liczba komentarzy: 0
Protokół – srebrzenie żeli MDE

Srebrzenie żelu MDE

Przepis ten pozwala uzyskać elegancki, niezabrązowiony żel MDE.

Żele te w metodzie SSCP służą do detekcji mutacji.

Po zakończonej elektroforezie żel można poddać srebrzeniu w celu uwidocznienia uzyskanych prążków. Proces barwienia DNA srebrem przebiega w kilku etapach. Pierwszy etap to utrwalanie polegające na odwodnieniu żelu, np. w roztworze etanolu.

Następnie żel traktuje się kwas azotowym, który ma na celu utrwalenie obrazu prążków na żelu. Kwas azotowy zapobiega dyfuzji cząsteczek kwasów nukleinowych z żelu oraz pomaga w pozbyciu się i neutralizacji niepożądanych odczynników (np. mocznika czy buforu).

MDE
Jeden z naszych żeli MDE wysrebrzonych za pomocą tego protokołu
Kolejny etap to właściwe barwienie srebrem, po którym następuje wywoływanie.
Podczas wywoływania dochodzi do redukcji srebra za pomocą formaldehydu, a węglan sodu zapewnia odpowiednie środowisko reakcji.

Związane z DNA zredukowane srebro przyjmuje brązowe zabarwienie, co pozwala na uwidocznienie badanych prążków. Ostatnim etapem jest zatrzymanie reakcji redukcji poprzez obniżenie pH, stosując np. kwas octowy.

Tak wysrebrzone  żele poddaje się dodatkowo suszeniu, co ułatwia ich przechowywanie.

Procedurę srebrzenia żelu MDE zamieszczono poniżej:
1. Żele przenieść do kuwety z 10% etanolem umieszczonej na kołysce na 5 minut.
2. Po zlaniu etanolu wlać do kuwety 1% kwas azotowy na 3 minuty.
3. Przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę.
4. Żele umieścić w 0,012M azotanie srebra i płukać 20 minut w ciemności.
5. W międzyczasie przygotować 2 litry 0,28M węglanu sodu.
6. Żele przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 minutę.
7. Żele zanurzyć w 0,5 litra węglanu sodu na kilka sekund (poczekać aż węglan zbrązowieje)
8. Do reszty węglanu dodać formalinę buforowaną 10% (2835μl na 1,5 litra węglanu sodu).
9. Żele płukać węglanem z formaliną (kilka razy – wlewać około 0,5 litra węglanu, po czym zlewać, gdy się zaczerni i dodawać  kolejną porcje, dopóki nie pojawią się prążki – około 15 minut).
10. Reakcję zatrzymać 10% kwasem octowym – 2 minuty.
11. Płukać w wodzie około 1 minutę.
12. Żele przenieść na przezroczysta folię np. spożywczą i i przykryć bibułą filtracyjną Whatmana.

Żele suszyć w suszarce do żeli – my używamy Gel Dryer (Biorad) podłączonej do pompy próżniowej (u nas jest Hydro Tech, Biorad) przez 45 minut w temperaturze 85°C.

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry