Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 16 października 2013

Liczba komentarzy: 0
ReliaPrepTM FFPE gDNA Miniprep System firmy Promega – Testujemy!

ReliaPrepTM FFPE gDNA Miniprep System firmy Promega jest zestawem do izolacji DNA dedykowanym dla tkanek zatopionych w bloczkach parafinowych.  Zgodnie z informacją podaną przez producenta do izolacji można wykorzystywać skrawki parafinowe grubości 5-50 μm.

Zestaw zawiera większość odczynników gotowych do użycia (Mineral Oil, Lysis Buffer, Proteinase K, BL Buffer, RNase A, Elution Buffer) i oczywiście kolumienki. Wyjątek stanowi jedynie odczynnik  Wash Solution, który wymaga dodania odpowiedniej ilości 95-100% etanolu przed rozpoczęciem procesu izolacji.

Producent podaje trzy protokoły postępowania:

– izolacja z odparafinowaniem przy użyciu oleju mineralnego

– izolacja z odparafinowaniem przy użyciu ksylenu

-izolacja bez odparafinowania

Producent zaleca stosowanie protokołu izolacji z użyciem oleju mineralnego.

Podczas testowania zestawu wykonano izolację 3 niezależnych próbek. Każdą z próbek wyizolowano przy pomocy wszystkich trzech protokołów. Do badań wykorzystano fragmenty tkankowe utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie. Próbki wybrano na podstawie wielkości materiału (próbka nr 1 – duża ilość badanego materiału, 2 –  średnia ilość badanego materiału, 3 – skąpa ilość badanego materiału).

  1. 1. Przygotowanie materiału do badania

Do badania przygotowano 9 skrawków parafinowych o grubości 4 μm, po 3 z każdego bloczka parafinowego. Skrawki parafinowe umieszczono w 1,5 ml probówkach, po jednym na probówkę.

  1. 2. Izolacja

Procedurę izolacji przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta.

Procedura izolacji DNA przy użyciu oleju mineralnego i ksylenu podzielona jest na 5 etapów – odparafinowanie, liza, traktowanie RNaza, wiązanie kwasu nukleinowego na kolumnie oraz płukanie    i elucja DNA   z  kolumny.

W pierwszym przypadku do przygotowanych próbek dodano oleju mineralnego i umieszczono na  1 minutę w bloku grzewczym o temperaturze 80°C. Następnie rozpoczęto kolejny etap izolacji – lizę próbki.

W drugiej metodzie do próbek dodano ksylen a po jego usunięciu etanol (95-100%). Po zwirowaniu     i usunięciu etanolu znad peletu próbki suszono w cieplarce w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie rozpoczęto kolejny etap izolacji – lizę próbki.

Proces izolacji DNA bez odparafinowania  składa się z 4 etapów –liza, traktowanie RNaza, wiązanie kwasu nukleinowego na kolumnie oraz płukanie  i elucja DNA  z  kolumny.

Procedura izolacji od etapu lizy do etapu płukanie i elucji DNA  z  kolumny jest identyczna dla wszystkich trzech protokołów.

Zaobserwowano, że w przypadku protokołu bez odparafinowania powinniśmy zastosować czas trawienia Proteinazą K dłuższy niż podany przez producenta – w przypadku naszej próbki widoczna była zawiesina niestrawionej tkanki.

Po otrzymaniu DNA zmierzono jego stężenie przy pomocy spektrofotometru NanoDrop 2000. Dokonano dwóch pomiarów, a średnie wyniki przedstawiono w tabeli.  Uzyskane roztwory DNA zweryfikowano elektroforezą na 2% agarozie przy napięciu 110V przez 30 minut.

 

Izolacja- Odparafinowanie (Olej mineralny)

 

Nr próbki

bloczek 1

bloczek 2

bloczek 3

Stężenie DNA [ng/ul]

Średnia

Średnia

Średnia

172,25

287,05

27,6

A260/280

1,94

1,9

1,825

 

Izolacja- Odparafinowanie (Ksylen)

 

Nr próbki

bloczek 1

bloczek 2

bloczek 3

Stężenie DNA [ng/ul]

Średnia

Średnia

Średnia

97,15

126

17,3

A260/280

1,9

1,86

2,215

 

 

 

 

Izolacja-  Bez odparafinowania

 

Nr próbki

bloczek 1

bloczek 2

bloczek 3

Stężenie DNA [ng/ul]

Średnia

Średnia

Średnia

52,2

79,8

17,2

A260/280

1,885

1,885

1,76

 

 

 

 

 

 

Od lewej seria próbek DNA z bloczka 1, 2, 3 izolowanych kolejno protokołami: z olejem mineralnym, ksylenem i bez odparafinowania. Po prawej marker długości 34-500 bp.

 

Zgodnie z zaleceniami producenta najbardziej wydajny okazał się protokół izolacji z zastosowaniem oleju mineralnego. Na podstawie otrzymanych wyników można zaobserwować, że wydajność procesu izolacji jest najmniejsza dla trzeciego protokołu. Ilość DNA otrzymana tę metodą jest praktycznie dwukrotnie mniejsza niż przy zastosowaniu ksylenu i blisko czterokrotnie mniejsza niż przy zastosowaniu oleju mineralnego. DNA ze złoża wymywa się  objętością 40ul roztworu elucyjnego, co nawet przy skąpym materiale powinno wystarczyć na kilka reakcji PCR.  Roztwory DNA cechowała duża czystość – stosunek absorbancji A260/280 wynosił 1,8-1,9.

Producent zastrzega sobie, że wydajność procesu izolacji może być uzależniona od typu tkanki, jej wielkości, wieku oraz warunków przechowywania.

Elektroforeza na żelu agarozowym ujawniła zaawansowaną fragmentację izolowanego DNA. Jest to jednak najprawdopodobniej cecha badanego materiału. W Polsce cały czas brakuje standardów jakości utrwalania materiałów tkankowych i przeprowadzania ich do bloczka parafinowego.

Zalety

– prosta procedura wykonania

-zastosowanie oleju mineralnego bezpieczną i skuteczną alternatywą dla ksylenu

– wyposażenie standardowego laboratorium wystarczające do przeprowadzenia procesu izolacji  zestawem firmy Promega, potrzebna jest wirówka oraz blok grzewczy.

– czas wykonania do 3-4 godzin (od etapu skrojenia do otrzymania DNA)

– większość odczynników gotowa do użycia

 

Wady

– w przypadku 1-go z protokołów konieczność stosowania ksylenu

– czas przewidziany do trawienia tkanki niewystarczający (w przypadku metody bez odparafinowania)

 

Promega

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry