Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 09 czerwca 2016

Liczba komentarzy: 0
Testujemy tanie polimerazy

Specjalnie dla Was postanowiliśmy w naszym laboratorium przetestować tanie polimerazy, których cena wynosi około 50 groszy za 1U. Ku naszemu zaskoczeniu tanie polimerazy sprawdzają się bardzo dobrze w rutynowych oznaczeniach wykonywanych metodą PCR.

Postanowiliśmy przetestować jakość nowego enzymu zawartego w polimerazach DNA pochodzącego z gatunku Pyrococcus furiosus, w odróżnieniu od najczęściej stosowanych enzymów, izolowanych z bakterii Thermus aquaticus.

W celu porównania wydajności reakcji PCR, użyto dwóch rodzajów zestawów enzymów służących do przeprowadzania reakcji PCR: Paq5000 DNA Polymerase (Agilent Technologies) oraz PfuPlus! DNA Polymerase (EURx). Jako matrycy użyto 3 próbek DNA izolowanego z krwi obwodowej. Powstałe produkty PCR w dalszej kolejności miały zostać poddane sekwencjonowaniu.

Reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50ul (w tym 2ul DNA) zgodnie z rekomendacjami producentów, ponadto skład mieszaniny PCR-mix oraz profil termiczny reakcji prowadzono również ściśle wg zaleceń producentów. Stosowano ten sam zestaw starterów o stężeniu końcowym 0,5uM a w celu optymalizacji PCR, reakcje prowadzono w gradiencie temperatur (50°C, 55°C oraz 60°C) w tym samym termocyklerze (Biometra). Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym.

W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że produkty PCR (rycina) odpowiadające szukanemu fragmentowi są zasadniczo tej samej intensywności po zastosowaniu polimerazy firmy Agilent Technologies oraz EURx. We wszystkich 3 amplifikowanych próbkach pojawił się  produkt PCR w temperaturach 50°C, 55°C i 60°C; w przypadku polimerazy Paq5000 DNA temperatura 50°C okazała się najbardziej optymalna,  natomiast w przypadku PfuPlus!, zależności od próbki, temperatura 50°C lub 55°C wydaje się być optymalna – wymaga to dopracowania warunków reakcji lub przeanalizowania większej liczby próbek. W pierwszej próbce amplifikowanej przy pomocy polimerazy PfuPlus! pojawiły się również ciężkie niespecyficzne produkty – ich eliminacja jest możliwa po dopracowaniu warunków reakcji.

Fotografia przedstawia wynik elektroforezy agarozowej próbek amplifikowanych przy pomocy 2 różnych rodzajów polimeraz. Możliwe różnice widoczne na rycinie wynikają z jakości zdjęcia żelu agarozowego.

 

Magdalena Zawada, dr n med.

diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki

 

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 0

Nikt jeszcze nie skomentował tego wpisu, napisz coś!
  1. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry