Rejestracja

Please leave these two fields as-is:
UWAGA: Prosimy o rozwiązanie prostego równania matematycznego!
zamknij

Zaloguj się

Zapomniałeś hasła?

Jeżeli nie pamiętasz swojego hasła, wyślemy Ci nowe - wystarczy skorzystać ze specjalnego formularza
Przypomnij mi hasło

Zarejestruj się
Napisano: 03 kwietnia 2015

Liczba komentarzy: 1
Test systemu do elektroforezy kapilarnej Qiaxcel

Systemów do elektroforezy kapilarnej jest obecnie na rynku sporo. Oprócz sprzężonych z sekwenatorami systemów do analizy fluorescencyjnie znakowanych kwasów nukleinowych istnieje kilka wielofunkcyjnych systemów rozdzielających cząsteczki w bardziej „konwencjonalny”, przypominający klasyczną elektroforezę, sposób. Dwoma największymi konkurentami na polskim rynku są Bioanalyzer Agilent’u i qiagenowskie urządzenie Qiaxcel. Miałam przyjemność zetknąć się z oboma systemami, chciałam jednak szerszej opisać kombajn firmowany przez Qiagen, ponieważ to na nim obecnie wykonuję rozdziały kapilarne.


Pierwsze wrażenie

Qiaxcel jest duży i kwadratowy. Gabarytowo: jak spora wirówka. W dodatku jak przystało na produkt Qiagena cechuje się swoistą i nie każdemu przypadającą do gustu estetyką: srebrna dość łatwo rysująca się farba i granatowe wstawki. Akurat małego Agilenta, o nowocześniejszej linii, uważam za ładniejszego i praktyczniejszego, chociaż oczywiście, jak mówi mądrość ludowa, liczy się nie wygląd lecz wnętrze…

Wnętrze

Idea systemu to rozdział pod wysokim napięciem kwasów nukleinowych w szklanych kapilarach. Płynny żel o różnym składzie dla różnych typów rozdziału (DNA/RNA, rozdział dokładny/screening itd.) jest wstrzykiwany pod ciśnieniem generowanym przez sprężony azot ze zbiornika do kapilar, następnie kwas nukleinowy wędruje pod ciśnieniem przez kapilary i urządzenie odnotowuje moment jego detekcji na wyjściu. Przed każdym rozdziałem aparat czyści kapilary ze starego żelu i przepłukuje je buforem zdalnie. Rezerwuary żelu są integralną częścią kartridży, które są wymienne i zależnie od typu i zastosowania starczają na kilkadziesiąt do kilkuset rozdziałów- ilość ta jest predefiniowana na chipie kartridża i nie można jej zmienić.

Barwnikiem używanym w systemie Qiaxcel jest bromek etydyny, co należy zaliczyć już na wstępie do wad urządzenia- ogranicza znacząco jego potencjał a także żywotność kartridża.

Jednorazowo Qiaxcel dokonuje rozdziału 12 próbek (kartridże posiadają 12 kapilar). Przy rozdziale mniejszej liczby próbek trzeba puste miejsca załadować PCRówkami z czystym buforem. Podraża to analizę pojedynczej próbki, gdyż maszyna wykorzystuje tą samą ilość żelu i azotu niezależnie od ilości zapełnionych miejsc w rządku. Maksymalna przepustowość przy jednorazowej analizie to jedna płytka 96-dołkowa (czyli 8 rozdziałów po 12 prób). Czas trwania pojedynczego rozdziału waha się od kilku do kilkunastu minut w zależności od użytego kartridża i doboru warunków. Tutaj akurat Qiaxcel dominuje nad Bioanalyzerem: może wykonać jednorazowo więcej rozdziałów, aparat robi to szybciej i łatwiej przygotowuje się próbki.

Obsługa

Po oswojeniu się z Qiaxcelem przygotowanie sprzętu do elektroforezy zajmuje kilka minut. Wyjątkiem jest pierwsze użycie każdego kartridża, które wiąże się z kalibracją intensywności sygnału. Przy pomocy dołączonego do zestawu stripa i buforu do kalibracji wykonuje się poprzedzony symulacją kilkunastominutowy run wstępny. Raz na jakiś czas, przy pogorszeniu tła elektroforezy należy także zmieniać bufory płuczące w wanienkach, z których korzystają kartridże podczas „toalety”. Wielorazowego użytku są też tzw. alignment marker i drabinki wielkości.

Qiaxcel
Próbki do elektroforezy z płytki lub stripa po prostu wkłada się w przygotowane saneczki. Trzeba jedynie sprawdzić czy w żadnej kieszonce nie zalega bańka powietrza, która skutecznie blokuje kapilary i może je nawet trwale wyłączyć z użytkowania. Można także korzystać z PCRówek, jednak trzeba im albo poodcinać łebki, albo umieszczać co 2 rządki, blokując kapselki o otwór z kolejnego rządku. Jest to jeden z mankamentów. Drugi to wielorazowość używanych buforów. Produkty PCR do czułych zastosowań downstream typu nested-PCR lub Real-Time, a także RNA należy rozpipetować, by nie przenieść z poprzednich analiz DNA lub rybonukleaz. Z tym wiąże się kolejna wada: Qiaxcel musi mieć co najmniej 12uL płynu, by nie było ryzyka pobrania powietrza w kapilarę. Samego materiału analizer pobiera minimalne ilości, ale nakropione musi mieć dużo więcej niż Bioanalyzer (w nim używany jest 1uL do rozdziału!).

Precyzja rozdziału sprzętu Qiagena jest imponująca jak na tak krótki rozdział na bromku etydyny. Na kartridżu „high resolution” dla fragmentów DNA poniżej 400nt udaje się uzyskać dobrze widoczne, rozdzielone sygnały dla różnic rzędu 4-6nt. Dla fragmentów ok. 1000nt jest to 10-20nt. Dokładność szacowania wielkości fragmentów na podstawie dołączonych ladderów przy wysokorozdzielczych kartridżach to ok. 2nt dla mocnych sygnałów i ok. 5nt dla sygnałów niewiele wyższych od poziomu tła. Niestety ze względu na właściwości EtBr czułość nie jest najmocniejszą stroną Qiaxcela: jest ona niewątpliwie wyższa niż żeli agarozowych, jednakże na agarozę można napipetować maksimum produktu PCR, tu zaś czas poboru materiału jest ściśle zdefiniowany i wpływa na rozdzielczość analizy (program „L” powoduje dłuższe pobieranie próbki, ale wpływa to na pogorszenie jakości rozdziału). Bromek w kartridżu szubko degraduje, więc z biegiem czasu jego fluorescencja maleje. W zasadzie jednak „hardware’ową” część obsługi urządzenia można ocenić bardzo pozytywnie. Co jednak tyczy się software’u…

Software

Tragedia. To słowo najlepiej opisuje parametr przyjazności oprogramowania dla przeciętnego użytkownika. Początki z obsługą Qiaxcela to sen wariata: przyciski i paski zadań porozmieszczane zupełnie bez sensu, żeby znaleźć jakąś opcję trzeba przekllikać w zasadzie wszystko, a i nie zawsze znajdzie się właściwy suwak czy okienko wyboru opcji. Nawet tak banalna rzecz jak opisanie próbek wymaga kombinacji alpejskich. Format wprowadzania danych to *csv, w którym nie można kopiować całych linijek i ogólnie prawie nic nie można. Żeby opisać płytkę 96-dołkową trzeba albo zrobić to 100% ręcznie, co zajmuje wprawnym palcom co najmniej kwadrans, albo przygotować arkusz w Open Office, przekonwertować do *csv i wgrać do Qiaxcela (ten sam format jest używany także w innych nowych urządzeniach firmy Q). Co ciekawe urządzenie nie przyjmuje konwersji z MS Excela! Z innych kwiatków: wgranie opisu makrerów wielkości wymaga często dopisania dodatkowych wierszy w tabelę, co na początku człowieka przerasta. Nie istnieje też szybki sposób na wyciągnięcie wynikowych plików graficznych w cywilizowanym formacie, ja omijam ten problem drukując pdf z grafiką, po czym wyniki wycinam z pdfów…

Jest jeszcze jedna ułomność obróbki danych: producent dodaje tylko 2 klucze USB do urządzenia, a to oznacza że nie ma możliwości (legalnego) przetworzenia i zanalizowania danych przez osobę nie posiadającą klucza. Pod względem oprogramowania Agilent bije Qiagen na głowę. Ich oprogramowanie jest dużo bardziej przemyślane, chociaż strasznie zamula system.

Problemy

Problemy z obsługą urządzenia zdarzają się, acz rzadko. Mieliśmy już w karierze kartridż przeterminowany przed czasem deklarowanym przez producenta (reklamacja została uwzględniona) i zatkane kapilary (udało się je odratować dzięki niezwykłemu protokołowi producenta i czajnikowi elektrycznemu x pokoju socjalnego). Podobno problemem może być pierwsza kalibracja, która jest wrażliwa na światło i wstrząsy.

Materiały eksploatacyjne

Ile kosztuje użytkowanie? Szacunkowo, przy założeniu że wykorzystany zostaje cały kartridż cena nie przekracza 3zł za próbkę, wliczając wszystkie materiały eksploatacyjne.

Podsumowanie

Qiaxcel w porównaniu z tradycyjnymi elektroforezami jest drogi, nie da się tego ukryć, jednak gdy zachodzi potrzeba precyzyjnego rozdziału większych ilości próbek: warto zastanowić się nad jego zakupem. Jak wszystkie tego typu urządzenia, nie jest systemem idealnym, ma sporo ograniczeń. Jednakże  do zastosowań półilościowych oraz jakościowych typu: analiza mutacji insercyjno-delecyjnych, ocena integralności RNA, precyzyjna ocena wielkości produktu PCR – nadaje się znakomicie. Trzeba jednak bardzo dobrze przemyśleć co i jak będziemy analizować, żeby nie wylądować w pracowni z niepotrzebnym meblem. Polecam kontakt z dystrybutorem Qiagena (http://syngen.pl/) w celu przeprowadzenia demonstracji, bo to najlepszy sposób na zapoznanie się z urządzeniem.

Ocena:

Wygląd i gabaryty: 3

Wygoda prowadzenia analizy: 6

Oprogramowanie: 2

Róznorodność zastosowań: 4

Ogółem:  4,5

Komentarz autorki (i współpracowników): Aparat podoba mi się.

Wynik multiplex PCR dla typu dzikiego (2 rząd) i podwójnego mutanta insercyjnego (3 rząd). W pierwszym rzędzie marker wielkości.

Marzena Pieronkiewicz

image_pdfimage_print
Podziel się ze znajomymi
Skocz do formularza

Komentarze 1

  1. 1

    Zamiast drukowac do pdf-a, polecam bullzip pdf printer i drukowanie – na tej samej zasadzie – do wysokorozdzielczego tiff (do 1200 dpi) – pozwlala ominaca wiele problemow tego rodzaju, przy uzyskaniu „publikacyjnej” jakosci grafiki. A co do tematu, czy mial ktos mozliwosc pracy z systemem LabChip GX II ? Jestem zainteresowany szybka, „wieloprobkowa” analiza bialek..

    4 lata temu
  2. Dodaj komentarz
    (wymagany)
    (wymagany)
    (wymagany)

    Pola oznaczone znaczkiem W są obowiązkowe. Musisz wypełnić wszystkie pola wymagane, aby dodać komentarz.
    Twój adres email, który podasz nie zostanie opublikowany z Twoim komentarzem.

    W treści komentarza dozwolone są tagi XHTML: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

do góry